临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料

1、临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第1页研究背景 样本采集、处理 样本保留 样本运输 DNA提取 RNA提取临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第2页研究背景一、样本采集、处 理、保留及运输临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第3页临床标本正确采集、运输、保留主要性临床检验质量确保关键性步骤处理包括试验室检验医患纠纷方法之一临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第4页（一）、样本采集地贫检测样品采集： 外周血: 5mL 脐带血: 0.51mL 羊 水：2030mL 绒 毛：15mg 唾 液 组 织临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第5页标本采集

2、注意事项全部标本采集、运输和处理应在无菌操作，预防污染标准下进行已采集标本都应置于防漏、密封无菌容器中运输采集足够量标本每份标本都应标识患者姓名、送检号码、标本起源、详细部位、日期、时间及相关临床信息临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第6页全 血以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂选择，普通使用EDTA-Na2或枸椽酸钠，不可使用肝素全血样本如用于DNA提取检测，可4下短期保留,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第7页血清（浆）DNA测定，可按照普通血清标本处理程序，对测定影响不大RNA测定，标本获取和保留方式对测定结果，可能有决定性影响。

3、最好是使用EDTA抗凝(禁止使用肝素)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本短期（12周）保留可在-20下，较长久保留应在-70下 临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第8页肝素作用机理 肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强抑制作用，假如临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中肝素可结合于DNA和RNA上对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、重复乙醇沉淀等均不能去除肝素这种干扰作用每g核酸标本中加入0.1U肝素，即可100%抑制酶活性在标本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸在于5 mM Tris pH7.5, 1 mM

4、CaCl2, 40 U RNasin 25 下作用2小时可去除肝素抑制作用临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第9页（二）、样本运输 样本一经采集，则应尽可能快送至检测试验室样本中如加入了适当稳定剂，如用于DNA测定EDTA抗凝血等，则可在室温下运输或邮寄提议：将全血标本或DNA样本用冰袋加泡沫盒快递运输。如需提取RNA样本需预处理后加lml Trizol在低温运输临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第10页（三）、样本保留常规外周血标本，采集后做血常规，常温24小时内，4可保留1周；做血红蛋白电泳常温1周，电泳4可保留15天；DNA提取样本常温24小时，4保留1个星期， 20 保留3个月

5、，70 保留六个月3年；RNA提取样本常温6小时，4保留12小时， 70 保留3个月，羊水在12小时内离心可保留同上。临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第11页研究背景 二、核酸提取临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第12页核酸提取主要性核酸提取是临床PCR检验最为关键个别，亦是手式操作主要个别核酸提取成败关系到临床PCR检验正确是否临床PCR检验操作中最易出问题步骤临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第13页（一）、提取核酸总标准确保核酸一级结构完整性；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用有机溶剂和过高浓度金属离子；其它核酸

6、分子，如提取DNA中RNA，也应尽可能去除。临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第14页（二）、核酸提取基础步骤1、核酸释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应最广泛方法）临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第15页各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 机械法1.匀浆法机体软组织2.捣碎法动物韧性组织3.研磨法细菌、酵母 物理法1.超声法细胞混悬液2.重复冻融法培养细胞3.冷热交替法细菌、病毒4.低渗裂解红细胞 化学法1.有机溶剂细菌、酵母、血液2.去垢剂组织、培养细胞、血液3.酶解法细菌、酵母、血液临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第16页2、核酸分离与

7、纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要核酸分子、试剂和溶液临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第17页3、核酸浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除个别杂质与一些盐离子加入一定盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%乙醇洗涤临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第18页 4. 核酸判定 浓度判定 纯度判定 完整性判定临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第19页浓度判定DNA：1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm光吸收值。 如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml紫外分

8、光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml核酸溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第20页RNA：紫外吸光光度法: A260稀释倍数40 g/ml(OD260-OD320)稀释倍数40 g/ml 临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第21页2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适合用于低浓度核酸溶液定量分析（1-5ng）临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第22页EB与DNA结合临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第2

9、3页纯度判定紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液光吸收，纯DNA A260与A280之比应在1.80 (1.601.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA残留量纯RNA A260与A280之比应在2.0(1.802.00), Ratio2.2 : RNA可能已经水解成单核苷酸A260/A280比值是纯度检测主要指标！注：测定吸光值，稀释液应使用临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第24页完整性判定凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，假如发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观察各条带含量，提醒是否存在RNA降解；如加样槽中存在

10、条带，可能是DNA污染。临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第25页DNA完整性判定：临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第26页 正常时，28S RNA荧光强度约为18S RNA2倍，不然提醒RNA降解RNA完整性判定：临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第27页5、核酸贮存DNA保留 1）短期贮存： 4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液PH与DNA 贮存相关，PH为8时，可降低DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA轻易变性。2）长久贮存： TE缓冲液中-70保留数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效预防细菌和核酸污染。临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第

11、28页核酸贮存RNA保留：RNA可溶于0.3mol/L醋酸钠溶液或双蒸水，在-70保留。RNA可溶于70%乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液中，可在-20 保留。RNA假如以DEPC（焦碳酸二乙酯）能够抑制RNA酶对RNA降解临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第29页三、基因组DNA分离与纯化临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第30页（一）、DNA样品准备 常见标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第31页DNA提取前样本采集、预处理和保留：全血 抗凝剂： EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为

12、抗凝剂 不宜使用肝素 抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80保留2个月，第10天收率90%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第32页（二）、DNA提取（一）酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最终乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100150kb。临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第33页酚抽提法提取步骤：临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第34页DNA酚抽提法示意图临床样本的采集运输和保存及核酸提取资

13、料第35页主要试剂作用： EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜稳定性临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第36页SDS作用：1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来3. 对RNA、DNA酶有抑制作用4. 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使蛋白质变性临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第37页蛋白酶K：水解蛋白质作用，消化DNA酶和细胞中蛋白质蛋白酶K与其它蛋白酶相比，它含有更强水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第38页苯酚：蛋白质

14、强变性剂、抑制DNA酶活性苯酚溶于有机溶剂，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，预防吸收过多DNA，降低DNA损失率氧化苯酚会破坏DNA临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第39页DNA沉淀：1）无水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面负电荷，有利于分子之间聚集。无水乙醇能够吸收分子之间水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，能够降低DNA沉淀析出过程释放热量对DNA损伤。2）异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还能够溶解少许小RNA分子临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第40页（二） 甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA结

15、合，再透析取得DNA。高浓度甲酰胺能够裂解蛋白质与DNA复合物，能够使蛋白质变性。降低了酚屡次抽提步骤甲酰胺解聚法适合用于从标本中制备高分子量DNA样品。可得DNA 200kb左右。临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第41页（三）磁珠法：磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH值下与核酸分离，再经过移动磁珠来获取DNA临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第42页（四）微柱法 ：利用DNA在高盐、低pH特定溶液环境下可吸附在固相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第43页（三）、DNA浓缩固体聚乙二醇（PEG）

16、浓缩：用透析袋 外敷PEG至适当量丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。所以重复几次可显著降低DNA体积临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第44页（四）、DNA回收 主要是从电泳中分离回收DNA片段回收标准：尽可能提升回收率 去除回收DNA样品中污染物临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第45页DNA降解原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶提取DNA生物活性差原因？ 提取基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未去除净 基因组DNA中可能存在其它抑制原因提取基因组DNA，有时加入蔗糖原因 加入多糖，保护DNA长度影响DNA质量原因临床

17、样本的采集运输和保存及核酸提取资料第46页四、RNA分离与纯化临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第47页（一）、样本起源理论上全部有核真核细胞、细菌、病毒都能够提取RNA样本选择取决于试验目标全血是基因组提取RNA最常见样本临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第48页每个细胞RNA量约为10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其它RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第49页组织材料起始样品量Total RNA提取量blood1ml1520gleukocytes1107个约100 gLiver

18、 tissue1g约5000 gCulture cells1107个约100gRenal tissue1g约3000gSkeleton tissue1g约1500gCerebral tissue1g约1500g临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第50页（二）、 RNA提取独特征关于RNase酶临床标本及试验室环境中,存在大量对RNA含有强烈降解作用RNase，而RNase较耐高温,不易失活怎样防止RNase对标本污染及预防RNase对提取RNA降解,是确保RNA成功提取关键之所在临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第51页RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于

19、人皮肤、唾液、汗液及周围环境中RNase含有水解核糖残基和磷酸二酯键RNase分子结构中二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase活性又可恢复临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第52页去除RNase污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功是否关键必须在总RNA提取分离最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase活性1. 内源性RNA酶（intrinsic RNase）临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第53页2. 外源性RNA酶(extrinsic RNase)主要起源： 被污染缓冲液 细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶 自动移液装置临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第54

20、页3. 试验室采取防止RNA酶污染办法设置专门RNA移液装置小份保留缓冲液设置专门RNA电泳装置准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶器皿、 DEPC处理水等分离RNA过程中使用RNA酶抑制剂临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第55页4. RNA酶去除DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中RNA酶。 OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%DEPC水溶液中， 37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相

21、容，故在分离和纯化RNA过程中不使用DEPC临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第56页5. RNA提取所用器皿处理经高压灭菌一次性使用塑料制品如试管,离心管等基础上无RNase,能够不经预处理直接用于制备和贮存RNA 试验室用普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡用于制备RNA烧杯,试管和其它用具DEPC是RNase强烈抑制剂。灌满DEPC器皿于37下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100干烤15分钟，最终高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量DEPC,以防DEPC经过羧甲基化作用对RNA嘌呤碱基进行修

22、饰临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第57页6. RNA提取所用溶液准备 对于RNA提取所需溶液配制,必须用高压灭菌水和RNA研究专用化学试剂配制溶液,用干烤过药匙称取试剂,将溶液装入无RNase玻璃器皿。可能话,溶液均应用0.1%DEPC于37最少处理12小时,然后于100加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟须注意是,DEPC可与胺类快速发生化学反应,所以不能用来处理含有Tris一类缓冲液,所以可存几瓶新,未开封Tris试剂以制备无RNase溶液临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第58页7. RNA提取中RNase 污染控制试验操作人员手是RNase污染最主要潜在起源。 策略是：在准备

23、用于RNA纯化试验材料和溶液时,以及在包括RNA整个提取操作过程中,都应戴一次性手套在RNA提取试验中，应勤换手套临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第59页（三）、用于提取RNA血样处理取新鲜抗凝血23ml入15ml无菌塑料管，600g离心5分钟，弃上清。 加入6倍细胞体积红细胞裂解液（约12ml），轻轻吹打混匀，本步骤在室温或4度操作均可。裂解时间至4-5分钟，而且裂解过程中宜适当偶然摇动以促进红细胞裂解。600g离心5分钟，弃红色上清。4离心效果更佳。普通情况下， 裂解1次红细胞应该裂解差不多，假如有较多红细胞没有裂解话，能够再加点红细胞裂解液约5ml裂解1次。步骤同3。向得到细胞团中加Trizol 1.0ml，弹匀，将细胞团打散，转入1.5ml无菌塑料管，封好盖。标上号，缠上封口膜，20 或70 保留。临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料第60页（四）、RNA提取常见方法 表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法胍盐提取结合氯仿-酚抽提法胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬