大鼠内耳的解剖结构与内耳膜迷路获取技术,人体解剖学论文

大鼠内耳的解剖结构与内耳膜迷路获取技术,人体解剖学论文大鼠作为动物模型，被广泛地应用于内耳研究中，包括化学制剂和重金属的耳毒性研究，噪声、冲击波的损害性试验，以及各种原因所致听力损失的治疗研究等。尽管各种实验的内容和目的不同，但都不可避免地需要观察和评估大鼠内耳的病理改变或者需要取出内耳膜迷路结合分子生物学检查方式方法评判某些特定基因或特殊蛋白质的变化。因而，了解大鼠内耳构造、把握大鼠内耳膜迷路取材技术是开展内耳研究的最基本训练科目之一。本文重点介绍大鼠内耳的解剖构造及大鼠内耳膜迷路取材技术，以期与同道沟通，并为初学者提供参考经历体验。1大鼠内耳的解剖构造大鼠内耳位于颞骨内，其骨性外壳被称为骨迷路〔BonyLabyrinth〕〔图1A〕，内部包裹与骨迷路形状类似的悬浮于外淋巴液中的膜迷路〔MembranousLaby?rinth〕〔图1B〕。内耳可分为前部的耳蜗〔Cochlea〕和后部的前庭〔Vestibule〕两部分。1.1耳蜗大鼠骨性耳蜗是一个中空盘旋2.2周的螺旋形骨管，华而不实心的蜗轴〔modiolus〕在大鼠正常头位时指向前下方。为描绘叙述方便，我们暂且规定蜗尖朝上。蜗轴上呈螺旋状发出的骨性螺旋板〔osseousspirallami?na〕自蜗底向顶部盘旋，向外与耳蜗基底膜〔basilarmembrane〕相接。在骨性螺旋板下方的蜗轴内部有一个类似螺旋式盘旋的骨管，称为蜗轴螺旋管〔RothenthalsCanal〕，其内为螺旋神经节〔spiralgan?glion〕，包括神经元〔SpiralGanglionNeurons,SGNs〕、胶质细胞、耳蜗传入和传出神经纤维等〔图1C〕。SGNs可分为Ⅰ型和Ⅱ型。华而不实Ⅰ型SGNs约占传入神经元总数的90-95%,Ⅱ型SGNs约占传入神经元总数的5-10%[1,2].两类传入神经纤维和传出神经纤维仅在穿出疆孔之前有施万细胞包裹，进入基底膜耳蜗螺旋器〔Cortiorgan〕的传入和传出神经纤维均裸露不再有髓鞘包裹。华而不实Ⅰ型传入神经末梢与内毛细胞〔InnerHairCells,IHCs〕建立突触联络，Ⅱ型传入神经末梢与外毛细胞〔OuterHairCells,OHCs〕相接〔图3A〕。进入IHCs下方的来自内橄榄核耳蜗束神经纤维的末梢与Ⅰ型传入神经纤维建立突触联络但并不与内毛细胞直接接触，而横穿Corti隧道进入外毛细胞下方的耳蜗上隧道传出神经纤维的末梢则与OHCs建立直接的突触联络。在一般情况下，一个内毛细胞与大约20个Ⅰ型螺旋神经节细胞的神经末梢相联络，而一根Ⅱ型传入神经纤维则与大约10个外毛细胞相联络。因而不难根据毛细胞的数目对Ⅰ型螺旋神经节总数和Ⅱ型螺旋神经节总数做大致的推算[1,3].蜗轴螺旋管内所有神经纤维的另一端经螺旋管内侧骨壁进入蜗轴中心会聚成听神经束，在内听道的底部向内转弯入颅。由于外毛细胞的高度自耳蜗底回向顶回逐步增加，内、外毛细胞的静纤毛长度也相应变长，因而Cor?ti器的高度、宽度及质量在耳蜗的不同部位并不一样，其受力后形变的程度〔其倒数即为劲度〕自然也不一样。小鼠耳蜗Corti器的宽度从耳蜗底回向顶回逐步变宽，但基底膜的宽度从耳蜗底回向顶回却是逐步变窄，这显然与很多教学材料中对耳蜗基底膜宽度描绘叙述明显不同[6].大鼠耳蜗Corti器的宽度从耳蜗底回向顶回也是逐步变宽，基底膜的宽度变化同样是由宽变窄，但是并不像小鼠那样明显，这一点显然既不同于教学材料中对人类基底膜宽度变化的描绘叙述也不同于小鼠的基底膜宽度变化特征〔图2C〕，因而，我们以为Corti器的宽度、劲度和质量才是造成耳蜗不同部位具有不同频率响应的关键因素，而并不完全取决于基底膜的宽度。1.2前庭大鼠的前庭由前庭池〔vestibularcavity〕和半规管〔semicircularcanals〕组成。前者位于内耳中部，其外壁中部的卵圆窗〔ovalwindow〕被镫骨底板及环韧带封闭，上壁与上鼓室相隔，后壁与弓状下窝相隔，内壁与后颅窝相隔，下壁介入构成岩骨底面颅底〔图1A〕。在大鼠前庭池内侧骨壁的前下方有一个扁平的球囊〔saccule〕，后上方为哑铃状的椭圆囊〔utricle〕〔图1D、2A〕。球囊的下方靠外经联合管〔ductusreuni?ens〕与蜗管相通，靠内经内淋巴管〔endolymphaticduct〕与内淋巴囊〔endolymphaticsac〕相通[7].开口于椭圆囊后壁下角的前庭导水管〔vestibularaqueduct〕也向内与内淋巴管汇合汇入内淋巴囊。在球囊的内侧外表有一个处于矢状面呈钩形的球囊斑〔maculasacculi〕〔图2D、3B〕，球囊斑的感觉上皮面对前庭池的外侧壁，球囊斑的底部则紧贴前庭池的内侧骨壁〔图1D〕。在椭圆囊的上部有一个处于冠状面呈扇形的椭圆囊斑〔maculautriculi〕〔图2D、3C〕，椭圆囊斑感觉上皮面朝向后方〔图1D、2A〕，其底面的神经纤维和毛细血管经上筛斑〔superiormaculacribrosa〕骨壁小孔通向颅内。在球囊斑和椭圆囊斑的外表均覆盖着胶状的耳石膜〔otolithicmembrane〕，耳石膜的表层覆盖着结晶体样的耳石层〔otoconiallayer〕。毛细胞的动纤毛和静纤毛插入到耳石膜内，当头位发生直线加速运动时，耳石膜因惯性与囊斑产生相对位移造成毛细胞的纤毛弯曲，感觉上皮因而而产生相应的神经冲动，进而产生身体直线加速运动的感觉[1,2].大鼠的半规管位于前庭池后方。这三个互相垂直的呈2/3环的中空骨管分别是外半规管〔lateralsemicircularcanal〕、上半规管〔superiorsemicircularcanal〕和后半规管〔posteriorsemicircularcanal〕，三个半规管借5个开口与前庭池相通。外半规管向外侧凸起，与水平面约成30角，其壶腹端开口和单脚分别开口于前庭池外壁的上部和下部；上半规管垂直向上向后凸起，与水平面垂直，壶腹端开口于前庭池上壁的后部，上半规管的另一端与后半规管联合构成总脚开口于前庭后壁中部的内角；后半规管向后向外凸起，与水平面几乎平行，其壶腹端开口于前庭池下壁的内角，另一端与上半规管联合构成总脚。大鼠的三个骨性半规管及其周围菲薄的骨壁共同围成一个开口朝向颅内的球形空洞〔图1A〕，内容小脑绒球叶。三个膜性半规管内充满内淋巴液，并借结缔组织小梁悬浮固定在充满外淋巴液的骨半规管内。在三个膜性半规管凸侧缘的壶腹内各有一个与半规管走向垂直的壶腹嵴。壶腹嵴的外表布满感觉毛细胞，毛细胞的动纤毛〔kinocilium〕和静纤毛〔ste?reocilium〕插入到壶腹嵴外表覆盖的胶质终帽〔cupu?la〕[1,2].当动物体位发生旋转运动时，与旋转平面平行的半规管内的壶腹嵴终帽就会与壶腹嵴产生最明显的相对位移，使毛细胞的纤毛随着终帽偏转并因而产生角加速运动的感觉。固然大鼠的外半规管壶腹嵴与人类、猴、豚鼠等实验动物同样呈马鞍形[3],但是大鼠的上半规管和后半规管壶腹嵴却被从嵴13D-F〕，这种构造到底具有什么特殊的生理学意义，当前尚不清楚。大鼠前庭各个感受器的构造基本一样，分布在各个感受器外表的Ⅰ型或Ⅱ型感觉毛细胞的底层均为一层支持细胞〔图1D〕。这些支持细胞构成了一道明显的分界限，所有的前庭神经纤维在穿越支持细胞之前都脱去髓鞘才能进入到前庭感觉上皮区实现与毛细胞之间的突触联络。来自前庭神经元的具有大神经纤维特征的传入神经末梢以高脚酒杯的形态特征将形似细颈花瓶的Ⅰ型毛细胞自底部一直包裹到颈部；具有小神经纤维特征的前庭神经末梢则仅在细胞底部与柱状的Ⅱ型毛细胞构成突触联络[1,2].支配或接受前庭上半规管壶腹嵴、外半规管壶腹嵴、椭圆囊斑以及球囊斑钩部的神经纤维均经上筛斑会聚到前庭上神经束〔图1D〕入颅，而支配或接受球囊斑主体部分和后半规管壶腹嵴的神经纤维末梢则分别经中筛斑和下筛斑会聚到前庭下神经束〔图2B〕。另外，球囊和椭圆囊还有一个最大的不同在于椭圆囊斑感觉上皮周围具有丰富的暗细胞群，而球囊内部却没有暗细胞〔图1D〕。球囊因而而不能产生内淋巴液，只能依靠从连合管接受由血管纹分泌的来自蜗管的内淋巴液，其内淋巴液的吸收则也只能通过内淋巴管聚集到内淋巴囊，这可能就是构成内淋巴液纵向流动循环的主要原因。与内淋巴液纵向流动循环截然不同的是，椭圆囊囊壁上的上皮细胞中含有大量的暗细胞，因而椭圆囊及三个半规管内的内淋巴液分泌和吸收大都以辐射流循环的方式来完成，也就是讲，在椭圆囊和三个半规管壶腹内的内淋巴液主要由周围的暗细胞分泌也由这些暗细胞吸收，这可能就是为什么毁坏内淋巴囊仅仅造成球囊和蜗管内积水但是却不能造成椭圆囊和半规管积水的重要原因[7].2大鼠内耳的解剖步骤观察大鼠内耳的病理变化通常能够采取颞骨切片和膜迷路取材及铺片两种方式。颞骨切片方式方法能够显示动物内耳的立体构造，充分展示内耳深部构造各个终器之间的相对位置关系；既能够证明耳蜗和前庭毛细胞的病理学改变，可以以观察位于螺旋管内的螺旋神经节细胞和位于上筛斑和中筛斑骨壁内侧的前庭上神经元和前庭下神经元病变，而且还能够评估血管纹、半规管、内淋巴管及内淋巴囊内的病理学改变。膜迷路取材及铺片方式方法除了能够对各感觉终器提供全面完好地定量分析之外，还能为进一步应用分子生物学研究手段提供纯粹的内耳实验样品，因而，膜迷路取材技术更有助于开展在基因水平和蛋白质水平上的研究[8-12].自1966年Engstrom重新提倡使用耳蜗铺片技术以来[13],很多研究者对耳蜗铺片技术进行了不断改良。我们于1979年在戴树宏教师最早在中国举办的耳蜗铺片学习班学会了Engstrom的经典耳蜗软铺片技术，我们在这里基础上首先提出了改进耳蜗硬铺片技术[14],随后又拓展了耳蜗螺旋韧带铺片[15]和前庭各终器铺片[16]乃至全内耳膜迷路铺片等一系列耳蜗膜迷路取材技术[17].由于不同动物的内耳解剖构造存在着一定差异，因而大鼠内耳的取材步骤与豚鼠内耳膜迷路取材并不一样[3].我们通过总结先前积累的实践经历体验，介绍两种不同的大鼠内耳膜迷路取材及铺片技术如下。大鼠内耳取材技术能够分为不经脱钙的膜迷路取材方式方法和经脱钙的膜迷路取材方式方法。前者主要适用于内耳膜迷路基因转染实验中对转染基因标记及转化蛋白质的观察、各种荧光免疫组织化学观察、以及为各种分子生物学研究提供不同的内耳组织材料。后者固然在显微操作上相对容易，但由于脱钙经过造成的酶蛋白失活和抗原抗体反响减弱或丢失以及染色标记褪色等问题，脱钙后取材的方式方法大多仅适用于常规病理学检查。根据不同的实验需求和染色标记步骤，样品染色或标记有时可能需要布置在组织固定之前有时需要布置在组织固定之后，这主要取决于标记信号能否需要进行活细胞标记以及标记物能否在脱钙经过中保存。例如琥珀酸脱氢酶不能耐受醛类化学固定剂，因此应用四唑盐法标记琥珀酸脱氢酶就必须对耳蜗施行先灌流染色然后再固定，由于四唑盐法产生的酶组织化学蓝色甲臜〔formazan〕沉淀物能够耐受脱钙处理，因而合适应用脱钙后取材的方式方法并根据软铺片的方式方法来制备样品；然而经转染后产生的绿色荧光蛋白以及各种探针荧光标记的蛋白质大多不能耐受脱钙，它们或者会在脱钙经过中丧失抗原抗体反响性，或者会在脱钙经过中发生荧光信号的淬灭，因此对施行荧光免疫组织化学染色的样品，我们主张采用不脱钙的方式方法来制备样品。2.1硬铺片法将固定后的颞骨置于盛有蒸馏水的玻璃皿中。在解剖显微镜下，用镊尖刺破蜗尖骨壁，将分离针探入顶回螺旋韧带与蜗壳之间并沿着螺旋韧带的背侧分离蜗壳，鼓室侧蜗壳较薄，在确保蜗壳与螺旋韧带完全分离后能够轻易摘除已分离的蜗壳；颞骨岩部侧的蜗壳骨壁较厚，则需要先将螺旋韧带与骨壁分离，然后再用剪刀剪除颞骨岩部侧骨壁，直至暴露整个耳蜗膜迷路〔图4A、B〕。用分离刀探入基底膜底面与骨性螺旋板之间的缝隙中，沿骨性螺旋板将基底膜从鼓阶朝蜗管方向轻抬，使耳蜗基底膜与蜗轴分离，此经过能够从蜗尖开场逐步向蜗底进行或者从蜗底开场向蜗尖推进。由于基底膜的外表没有骨组织阻挡，分离开的基底膜朝着蜗管方向弯曲不会造成基底膜折断，同时由于操作器械是从基底膜的反面向上抬，因而也不会造成Corti器的机械损伤。取出耳蜗膜迷路之后，可用显微剪将螺旋韧带剪除〔图5E〕，可以以将基底膜的顶回、中回和底回分别切断，然后再用分离刀沿着基底膜的外侧缘将螺旋韧带切下，最后用游丝镊摘除覆盖在Corti器外表的盖膜〔图5F〕并完成耳蜗基底膜铺片〔图2C、3A〕。解剖前庭各个终器的方式方法是在摘除镫骨底板后，沿着卵圆窗边缘打开前庭池外壁充分暴露前庭池。在前庭池内壁前下方可见钩形的球囊斑，在前庭池的后上方可见扇形的椭圆囊斑，由于这两个囊斑的外表均覆盖着白色的耳石膜使之成为两个囊斑的最夺目标志，因而很容易分辨体认。椭圆囊斑和上半规管及外半规管壶腹均位于面神经管内侧深部。需要先打开面神经管外侧壁摘除面神经，再打开面神经管内侧骨壁才能充分暴露椭圆囊的囊斑和两个膜壶腹〔图4B〕。球囊斑与前庭池内壁的附着较为严密，需要用分离针探入球囊内侧壁和骨壁之间进行分离，然后取下被分离的整个球囊。椭圆囊和上半规管、外半规管壶腹相对游离，与椭圆囊斑和外壶腹嵴及上壶腹嵴相联络的神经纤维从上筛斑外表的小孔进入骨壁会聚成前庭上神经束，因而只要将椭圆囊斑和两个膜壶腹进入上筛斑的神经纤维和血管在上筛斑处截断就能够将椭圆囊斑和外半规管及上半规管壶腹取下。后半规管壶腹的位置埋藏在蜗管底回hook后方的骨壁深部〔图2A、B〕，需要撬开周围骨壁方可暴露，然后将后壶腹通向下筛斑的神经纤维截断即可将后壶腹完好取出。获得所有前庭终器后，还需打开球囊和椭圆囊的囊膜并切除囊斑周围多余的膜性组织，再用游丝镊去除两个囊斑外表覆盖的耳石膜，使两个囊斑外表的感觉毛细胞充分暴露。撕开三个膜壶腹充分暴露壶腹嵴，最后将囊斑和壶腹嵴的正面朝上铺放在载玻片上的甘油滴中，盖上盖玻片〔图2D、3B-F〕。2.2软铺片法经过脱钙处理，骨组织中原先含有的钙盐基质被除去，由于原先坚硬的骨组织变成了软组织，因而脱钙后施行膜迷路取材的难度要比不脱钙取材容易。将颞骨置于盛有蒸馏水的玻璃皿中，以类似不脱钙分离的解剖手法，先分离蜗壳与螺旋韧带，由于骨组织经脱钙后已经变软，分离时需要将分离针沿着蜗壳和螺旋韧带之间的间隙进行分离，同时要注意防止撕扯骨壁，以免牵拉造成耳蜗变形而撕裂基底膜。暴露整个膜迷路后，用游丝镊从听神经孔取下蜗轴。再用游丝镊和分离刀将整条耳蜗基底膜按底回、中回和顶回截成三个片段〔图5A-C〕。用游丝镊夹持蜗轴，再用分离刀沿着基底膜的内侧缘切除蜗轴〔图5D〕。然后用分离刀沿着基底膜与螺旋韧带交界处插入，用游丝镊沿着分离刀的刀刃将螺旋韧带与基底膜分开〔图5E〕。最后用游丝镊摘除盖膜〔图5F〕并完成耳蜗基底膜铺片〔图2C〕。由于很多药物造成的耳蜗毛细胞损害都表现出一个从耳蜗底回开场逐步向耳蜗顶回扩展的病变形式[18-23],因而选自耳蜗基底膜上某一部位的照片并不能有效表示出整个耳蜗的病理学改变特征。我们主张在放大400倍的光学显微镜下，以目镜中长度单位为0.24毫米的显微测微尺从耳蜗顶回向底回依次测量基底膜的长度并对逐个测微尺视野内的内外毛细胞进行计数，同时将计数结果输入到计算机与大鼠耳蜗图软件中的正常值进行比拟，进而建立全耳蜗毛细胞损失百分比的曲线分析图。我们以为只要施行全耳蜗毛细胞计数并