分子生物学第10章基因文库和目的基因的分离

10.1基因文库的构建10.2克隆已知基因产物或核苷酸序列信息的基因10.3蛋白质功能互补克隆10.4定位克隆10.5差示减法杂交法系列10.6通过DNA全序列分析确定基因10基因文库和目的基因的分离建立基因文库的意义

为了深入揭示生命活动的奥秘，必须研究基因的结构、功能、表达、调控。而要对某个特定基因进行研究，又必须把这个基因分离出来。为了在庞大的基因组中准确地找出特定的基因，首先需要建立基因文库。

基因文库的概念

基因文库分为基因组文库和cDNA文库两种。基因组文库是将来自一个有机体的不同随机DNA序列片段与载体重组，转化受体细胞，得到该物种基因组的一群重组体克隆。这些克隆的集合体即为基因组文库，其中包含了该有机体基因组的全部序列。在这些克隆中，有序列重复和序列重叠。cDNA文库是提取某一生物材料（组织、细胞）的总mRNAs，反转录成cDNAs，再与载体重组，转化受体细胞，得到克隆的集合体。（注意没有酶切步骤，与载体连接时的末端处理除外）基因文库的作用是从中筛选目的基因或特定序列。图10－1基因文库的构建基因组文库的内容

基因组文库包括了基因上游调控序列、内含子、外显子、下游序列等，如果为了研究基因的结构和表达调控，应建立基因组文库；基因组文库还可以用于研究不同基因在染色体上的排列情况。基因组文库实际上是DNA文库，它是以DNA片段为克隆对象，而不是以基因为克隆对象。

基因组文库的大小

在建立高等真核生物的大型基因组DNA文库时，需要克隆大量的不同DNA片段，才能以一种合理的概率获得含有目的基因的克隆。以人β－珠蛋白基因为例，其大小约为1.5kb，而人的单倍体基因组总长度为3×106kb左右，若按片段的平均长度为1.5kb计算，理论克隆数为2百万（3×106/1.5）。基因组文库的大小

由于DNA片段是随机克隆的，这个理论克隆数只是基因组文库所需要的最小值。从统计学上讲，这意味着一个只有理论克隆数的基因组文库中含有一种特定的单拷贝基因的概率只有50%。而当基因组文库的克隆数为2倍理论克隆数时，这个概率提高到75%。因此，为了能够以一种合理的概率筛选出单拷贝的目的基因，一个完全的基因组文库就必须含有3～10倍于理论克隆数的克隆。实际克隆数的计算公式

1975年L.Clarke和J.Carbon提出了一个计算一个完全基因组文库所需实际克隆数的公式：

式中N为所需要的实际克隆数；p为在基因组文库中出现目的基因的概率（一般要求99%）；f=DNA片段平均长度/基因组DNA总长。实际克隆数的计算

以单倍体基因组总长度为3×106kb左右为例，片段平均长度为1.5kb时，而片段平均长度为2kb时，

从式中可以看出，DNA片段平均长度越长，N值越小，所以在建立基因组文库时，应选用大容量的载体，以减少克隆数。DNA片段的制备

纯化的基因组DNA必须切割成适当大小的片段才能与载体重组，因为任何一种载体都有容量限制。选用不同的载体就要将DNA切割成相应大小的片段。DNA片段越大，包含基因组DNA全部序列的克隆数就越少。所以应选用容量大的载体。DNA片段的制备

首先要提取和纯化核基因组DNA（根据研究目的，还可以是细胞器基因组DNA），在提取和纯化时，尽量不要让DNA断裂成太小的片段。若用限制性内切酶部分消化来获得适合某种载体携带的DNA片段，则DNA的初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则生成的有效片段相对较少（一端为酶切出的粘性末端，另一端为机械力造成的平端为无效片段）。DNA片段的制备

用粘粒构建基因组DNA文库，初始DNA的长度应大于200kb；若以取代型λ噬菌体载体构建文库，初始DNA应大于100kb。控制限制性内切酶的加入量及消化的时间，可使酶切片段成为适当的长度，对粘粒载体要求45kb左右，对取代型λ噬菌体载体要求20kb左右。DNA片段的制备

物理剪切产生适合克隆的DNA片段的方法有抽吸、高速搅拌和超声波处理等。物理剪切的随机性比限制酶部分消化要好，但物理剪切产生的片段与载体连接较困难。DNA片段的制备结果图多个相同的DNA分子切割重复和重叠的片段

限制性内切酶消化或物理剪切后有些太长或太短的片段不适合克隆，应通过琼脂糖凝胶电泳或蔗糖密度梯度离心，分离出大小适合克隆的片段，与载体重组后转化或转导大肠杆菌。cDNA文库的用途

cDNA文库含有各种mRNA的序列，含有翻译调控序列和蛋白质的编码序列。为了研究基因编码区的结构或蛋白质的氨基酸序列，应建立cDNA文库。cDNA文库的类型

cDNA文库一般分为表达型文库和非表达型文库，对于用抗体筛选或生物活性筛选，应采用表达型文库，表达型文库用表达型载体构建，即在外源DNA插入位点的5’上游有强启动子，如λgt11、λZAP等；而非表达型文库只能用DNA探针筛选，用非表达型载体构建，如λgt10，探针可根据已知氨基酸序列反推核苷酸序列人工合成，也可根据其他亲源关系相近物种的同源序列合成。cDNA文库的大小

对于高丰度的mRNA，可构建相对较小的cDNA文库；而对于低丰度的mRNA，就应构建较大的cDNA文库；对于极低丰度的mRNA，应先进行富集，如按mRNA大小分级、按cDNA大小分级、免疫沉淀多聚核糖体等，这样能大大减少cDNA文库的克隆数。文库的大小由用来反转录的mRNA的量决定。cDNA文库的制备提取和纯化总mRNA以mRNA为模板，逆转录合成cDNA第一链以cDNA第一链为模板，合成cDNA第二链双链cDNA与载体连接重组载体转化或转染宿主细胞培养、选择阳性克隆mRNA的提取

尽量选择目的mRNA丰度高的组织和时期提取mRNA。提取mRNA的一般方法是先提取总RNA。在液氮中研磨植物材料，然后加入提取液提取；对于动物培养细胞一般采用SDS和蛋白酶K裂解细胞后提取，而动物组织采用研磨提取。再经过各种萃取、沉淀步骤纯化总RNA。

在RNA提取纯化过程中，特别要注意避免RNase的破坏作用。

mRNA的提取

从总RNA中分离mRNA采用oligo(dT)12-18-cellulose柱层析法，上样后先用上样缓冲液（含有0.5mol/LNaCl）洗至OD260接近或等于0，再换用不含NaCl的洗脱缓冲液将结合在柱上的mRNA洗脱下来，洗脱的产物中一般有一半带有poly（A）尾。为了进一步纯化mRNA，可将产物再进行一次柱层析。图10－3cDNA第一链的合成图10－4自身引导法合成cDNA第二链图10－5RNaseH法合成cDNA第二链图10－6PCR法扩增cDNA双链cDNA与载体的连接1.同聚物加尾连接：为了使克隆效率达到最佳，质粒和cDNA上的同聚物残基数应当接近相等，同聚物为dA和dT时应为100个左右，为dC和dG时应为20个左右。此法不能用于λ噬菌体载体。用质粒载体构建的文库要比用λ噬菌体载体构建的文库更难以贮存和复制。cDNA与载体的连接2.加连接子连接：给已成平端的cDNA两端接上连接子，再用限制酶切连接子产生粘性末端与载体连接。由于在cDNA中也可能有此限制酶的识别位点，酶切时可能会将cDNA切成两段或更多段。要解决这个问题，可在加连接子之前先用识别该位点的甲基化酶对cDNA中可能存在的限制酶切位点甲基化，将这些位点保护起来，然后再加连接子连接。cDNA与载体的连接3.加适配子连接：由于适配子本身就带有粘性末端，不需要再用限制酶切割，因此不会造成cDNA被切断的情况。但在用限制酶取出外源DNA时有可能被切断。cDNA的正确表达

对于建立表达型cDNA文库来说，cDNA插入的方向和阅读框的正确非常重要，若按一般方法插入，只有1/6的重组DNA能表达出正确的蛋白产物。若给cDNA两端接上不同的连接子，载体也用相应的两种限制酶切，则可以以正确方向插入，能表达出正确蛋白产物的比例提高到了1/3。为了提高正确表达率，还可以采用三种不同长度(相差一个核苷酸)的连接子或适配子，以保证插入片段有一个正确的阅读框。使用λ噬菌体载体制作文库

用λ噬菌体载体时，载体应过量，并事先除去5＇端磷酸以防止载体自身连接。经大肠杆菌DNA连接酶或T4DNA连接酶连接后，用λ噬菌体包装蛋白体外包装成有感染力的噬菌体颗粒，通过转导进入宿主大肠杆菌中。λ重组载体的包装方法

包装的方法有两种：一种是用两种溶源菌的提取物混合包装。BHB2690菌株中的原噬菌体有D基因突变，不能产生D蛋白。D蛋白位于头部的外面，参与λ噬菌体DNA进入前头部和头部的成熟这两个连续过程。D基因突变可以积累前头部，但不能使DNA插入头部，所以不能裂解宿主菌。BHB2688菌株的原噬菌体有E基因突变，E蛋白是头部的主要组成成份，E基因突变不能形成前头部，可以积累大量的各种其它蛋白，也不能裂解宿主菌。

λ重组载体的包装方法

先在32℃培养溶源菌至对数中期，将培养温度提高到45℃保温15分钟，以灭活cⅠ阻遏物并诱导裂解功能，再将细菌于38～39℃培养2～3小时，使包装蛋白逐渐积累，然后制备细菌提取物。用超声波破碎菌体后离心得到上清液即为提取液，这两种细胞提取液和重组λ噬菌体DNA混合后可自动包装成有感染力的噬菌体颗粒。λ重组载体的包装方法

另一种方法是用一种溶源菌提取物包装。SMR10菌株中的原噬菌体编码有包装所需的全部蛋白，但其cos位点缺失，诱导后产生的噬菌体DNA不能进入前头部。包装后转导的效率为108pfu/μg（pfu，plaqueformingunit，噬菌斑形成单位），要比用重组λDNA直接转染大肠杆菌高得多。目的基因的克隆用目的基因的杂交探针原位杂交，从基因文库中分离目的基因探针的制备：①人工合成的寡核苷酸：已知蛋白质的氨基酸序列，反推出其基因的核苷酸序列，合成简并探针。尽量避免多密码子的氨基酸区段。②同源探针：利用目的基因在另一物种相应基因中的同源保守序列作探针。表达融合蛋白和独立的外源蛋白

在λZAP中，多克隆位点位于lacZ‘基因之前，合成出来的融合蛋白的氨基端为外源蛋白，羧基端为半乳糖苷酶的146个氨基酸。也有一些表达载体可以表达出独立完整的外源蛋白，如pKC30和pKK177-3，它们不产生融合蛋白，前者利用λ噬菌体的PL启动子，热激诱导表达；后者利用tac启动子，它是一个trp-lac杂合启动子，由lac阻遏物所调控，受IPTG诱导表达。目的基因的克隆2用抗体筛选表达文库

若使用表达载体构建cDNA文库，可以表达出各cDNA编码的蛋白质，这种cDNA文库叫表达文库。将表达文库的平板转印到硝酸纤维素膜上，裂解细胞后酶联免疫检测或125I标记抗体放射自显影检测。可以从表达文库中筛选出阳性克隆。此法要求宿主菌本身不合成该蛋白。

基因组文库不能是表达文库。酶联免疫检测

将菌落转印到NC膜上，用氯仿蒸气处理膜，使细菌在膜上裂解，或45℃高温诱导溶源菌裂解。然后加一抗结合，酶标二抗结合，加底物显色。双位点检测法

双位点检测法特别适合于检测融合蛋白：可把抗A-B融合蛋白A部分的抗体固定在固体基质上，最简单的方法是将抗A抗体直接涂抹在聚乙烯平皿上，然后将已裂解的转化菌转印到此平皿上，这时A-B蛋白通过A部分与平皿上的抗A抗体结合。再加放射性125I标记的抗B抗体，这些抗体结合到A-B蛋白的B部分。最后放射自显影，从原菌落复制平板上挑选阳性克隆。目的基因的克隆3用识别位点探针筛选表达文库

特定序列的双链DNA经标记后，可用于筛选能与该序列特异结合的DNA结合蛋白。如用启动子上的顺式元件筛选与之结合的转录因子。目的基因的克隆4蛋白质功能互补寻找目的基因

用突变体宿主菌，此宿主菌因某基因突变，带有容易检测出的缺陷表型，若用携带外源该正常基因的表达型载体转化，可使宿主菌的缺陷表型得到纠正，即为蛋白质功能互补。其理论基础是有些基因产物在不同的生物种中能发挥同样的功能。常用的宿主菌是营养缺陷型宿主菌。图10－8经酵母功能互补分离血红素生物合成的铁螯合酶基因(1)图10－8经酵母功能互补分离血红素生物合成的铁螯合酶基因(2)定位克隆

如果不知道某个基因的核苷酸序列和其表达产物的氨基酸序列，也没有其表达产物的抗体，只知道它造成的表型特点，就可以采用定位克隆的方法来寻找该基因。定位克隆可以搞清楚基因在染色体上的位置及相邻基因的位置关系，也可以找到被不同克隆分割开的一个完整的大基因。

酵母人工染色体

为了减少染色体步查时的工作量，要求基因组文库的克隆数少为好，因此要求每一个克隆的外源DNA片段要大。酵母人工染色体（Yeastartificialchromosome,YAC）也是一种DNA载体，与外源DNA重组后转化酵母菌，在宿主菌内的表现和染色体一样，可以复制和分配到两个子细胞中去。YAC可以克隆很大的DNA片段（200～500kb）。pYAC4的特点①一对来自四膜虫染色体的端粒(TEL)②一段来自酵母染色体的着丝粒序列(CEN4)③一段控制酵母染色体复制的自主复制序列(ARS1)④在酵母菌中的选择标记(左臂TRP1和右臂URA3，可与营养缺陷型宿主菌互补而筛选)⑤在大肠杆菌中的复制起点(Ori)⑥在大肠杆菌中的选择标记(ampr)⑦插入失活标记(SUP4)⑧一些限制酶切位点，其中位于SUP4中有一个EcoRⅠ位点用于插入外源DNA。YAC文库构建的基本步骤基因组DNAYAC文库构建的基本步骤YAC文库的构建和筛选

pYAC4在大肠杆菌中扩增，提取出来后用BamH1及EcoRⅠ切割，分离纯化两臂，除去两BamH1位点间的短片段。用小牛肠碱性磷酸酶CIP处理脱去两臂的5＇磷酸以避免载体自身连接。加入用EcoRⅠ部分消化并经脉冲电泳分级的基因组DNA片段（contigs，重叠群），连接酶连接，转化受体酵母菌，在选择培养基中选择阳性克隆（红色菌落）。YAC文库的构建和筛选

选择培养基缺色氨酸和尿嘧啶，被YAC转化了的酵母菌能在选择培养基上生长。选用的受体菌带有ade2赭石突变基因，ade2编码有关腺嘌呤合成的一个必需酶（磷酸核糖氨基咪唑羧化酶），该酶突变后腺嘌呤不能合成，从而积累腺嘌呤的前体磷酸核糖氨基咪唑（粉红色），使菌落成粉红色。YAC载体中带有SUP4，这是tRNATyr赭石校正基因，载体转化受体菌后，代谢正常，形成白色菌落。若有外源DNA插入SUP4中，不能校正赭石突变，形成红色菌落。三种终止密码子的别名UAAochre赭石密码UAGamber琥珀密码UGAopal蛋白石密码染色体步查的基本原理和步骤

根据遗传图谱，选择与目的基因连锁并相距最近的分子标记开始，此标记称为旁侧标记（flankingmarkers），常用的分子标记是RFLP和RAPD。一旦鉴别出了最紧密连锁的旁侧标记后，步查就可以开始了。这包括分离在一系列连续的交叠克隆（acontig）中旁侧标记之间的DNA。染色体步查的基本原理和步骤

第一步是用旁侧标记的探针筛选基因组文库。制备探针的方法依赖所用旁侧标记的性质，如果旁侧标记是常规的RFLPs，则用来检测RFLPs的探针可以直接用于筛选文库；如果用的是基于PCR的标记，制备探针的方法依赖所用标记的类型和被筛选的文库类型。对于涉及到许多不连锁DNA片段扩增的标记，应该只用相应的连锁片段作探针。对于只扩增单个特定DNA片段的方法，如切割扩增多态性序列（cleavedamplifiedpolymerphicsequence,CAPS）标记，可以直接将引物用于基于网格状YAC文库的筛选。

染色体步查的基本原理和步骤

用每一个旁侧探针第一次筛选通常产生一组（cluster）YACs。如果两个旁侧探针相距很近，且YAC文库的插入片段很大，两个探针可以杂交到同一个YAC上，说明这个YAC包括了目标基因。如果两个YAC组不相连，就需要继续步查。用探测到的YAC的外源DNA片段的两端制作的探针可以作出更详细的图谱，这将确定YACs的末端关于同组其它YACs的图谱定位。

染色体步查的基本原理和步骤

除了两个末端外，所有末端都应该至少杂交到另一个YAC上，这两个末端代表了这组YACs的最近端和最远端（极末端）。以此极末端序列为探针，从分离群体中测定这两个探针序列与目的基因的遗传距离（交换率），选择与目的基因距离较近的那个极末端探针，再开始第二步探测。重复这些步骤，直到探针序列与目的基因的遗传距离为0或又变大为止。

染色体步查的基本原理和步骤

从第二步开始，也可以通过作限制酶切图谱与前一片段比较来找出步查的方向。最后将目的基因定位到一个DNA片段上。必须注意的是，探针序列不能是重复序列。染色体步查的基本原理和步骤

由于YAC携带的外源DNA片段很大，寻找到含有目的基因的DNA片段后可以将其切割成更短的片段，用粘粒载体亚克隆后继续细找。并通过功能互补法（或功能测定）找出确定的片段。

对于已建立了高密度遗传标记的植物来说（如拟南芥菜），只需一两步即能找到目标片段。当相关物种间有同线性存在时，一个物种中的标记也可用于另一个物种。目的基因的克隆Ⅳ

5定位克隆—染色体步查法转座子标签法的基本原理

首先将一对亲本杂交，亲本之一应含有活性的转座子（自主转座子），然后对子代中目的性状发生的突变进行筛选，选择比自发突变频率高10-4～10-3范围内的突变，这种突变很可能是由于转座子插入了控制突变表型的基因造成的。用突变个体构建基因组