DNA的复制与修复

DNA的复制与修复

基因(gene)是生命体遗传信息的传递体，是编码生物活性产物（蛋白质或各种RNA）的DNA功能片段，其功能的体现遵循中心法则。

1958年，F.Crick提出中心法则：

后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。

第一节DNA的复制生物体的遗传信息储存在DNA中，并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自

DNA转录给RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。子链继承母链遗传信息的几种可能方式

全保留式半保留式混合式1.半保留复制的证明1.半保留复制的证明一、DNA的半保留复制

1.概念：

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。

2.DNA的半保留复制实验依据

1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.梯度密度离心实验

——实验结果支持半保留复制设想的。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果重DNA普通DNA普通DNA轻DNAN15-DNAN15N14DNA按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。二.DNA复制的起始点与方向1.复制起点（originori或o复制原点）：DNA复制都是在特定起始部位开始。这一特异部位称为Ori。大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一个Ori位点，而真核生物染色体中有多个Ori。

Ori是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。一般由100-200个碱基对组成，富含A.T。

1983年，Zyskind等人比较了6种不同种类的细菌染色体复制起点的DNA序列（包括E.coli、鼠伤寒沙门氏菌、肝炎杆菌和一种海洋细菌等），发现它们具有共有序列,包括二个必需区域：一个是9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白DnaA特异结合，对于DNA复制的起始十分重要；另一个是3个连续出现的13bp序列，富含A和T，有利于双螺旋DNA局部解旋并暴露两条复制模板链。细菌的Ori结构特点：串联重复序列(tandemrepeat):A-T

回文结构(palindrome)复制子:基因组中能单独进行复制的单位。每个起始点到终止点的区域为一个复制子。单复制子:一般原核生物细胞多复制子：真核生物细胞核DNA。

真核生物（Eukaryote）:多复制起点即－－一个genome中有多个复制单位Replicationfork

富含AT&发夹结构“呼吸作用”十分明显

许多酶的结合位点一般由100-200个碱基对组成，富含A.T。ATrich2.DNA复制的方式双向复制：大多数（等速进行或异速进行），形成两个复制叉。单向复制：少数，形成一个复制叉。复制叉----复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构，称为复制叉。

复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA,复制的区域形如一只眼睛.真核生物的多复制子多个复制眼DNA复制的方式复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制复制的多模式

A.单起点、单方向（原核）B.多起点、单方向（真核）C.单起点、双方向（原核）D.多起点、双方向（真核）原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。（1）比较形象的－－θ

复制ZP41

双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像希腊字母θ.称θ形复制起始点复制叉的推进

（2）

D-环型（D-loop）：

这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即D-环）。（2）D环复制（不对称复制）

线粒体和叶绿体DNA的复制方式。

ZP43图2-22

WP411图34-8（3）共价延伸方式或滚环式复制

这是单向复制的特殊方式。如ΦX174的双链环状DNA复制型（RF）就是以这种方式复制的。DNA的合成由对正链原点的专一性切割开始，所形成的自由5’端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，使其3’—OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。共价延伸方式或滚环式复制

由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制。

病毒、细菌因子

ZP42图2-21

cyclingamplification5‘3‘3‘3‘复制反应可看成生长点沿着环状的模板链滚动。在这个过程中，单链尾巴的延伸与双链DNA的绕轴旋转同步。复制一圈，就产生单位长度的线性DNA链，复制继续进行，可产生多单元线性DNA链。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。

在链的延长过程中，链的游离3’-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α-磷原子发生亲核攻击，生成3’5’-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。因此，每掺入一个核苷酸消耗2个高能磷酸键。

DNA聚合酶催化的链延长反应3´5´模板链5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´第二节.原核生物DNA的复制

有关的酶类

（1）DNA聚合酶（2）引物合成酶

和引发体

(3）DNA连接酶（4）DNA解链酶

(5）单链结合蛋白SSB(6）拓扑异构酶

解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物一.复制有关的酶

（一）.大肠杆菌DNA聚合酶

1.DNA聚合酶I单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNApol.Ⅰ（1）5’→3’聚合活性：与模板链结合，按碱基互补原则，催化3’5’磷酸二酯键的形成。但只能延伸DNA链。（2）3’→5’外切活性：校对的功能，从单链的3’末端切除不正确配对的核苷酸。（3）5’→3’外切活性：只作用于双链DNA,从5’切除引物，也可以从5’端切除错配碱基。

5’-3’聚合酶活性模板引物-3’OH3’→5’外切酶活性

DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸3’-5’外切酶活性5'→3'外切酶活性从5’-P端依次切除，可连续切除只切配对的5’-P末端核苷酸既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸2.DNA聚合酶II多亚基酶，分子量120Kd，约含100个/cell5’→3’聚合(活性很低)

只有DNApolⅠ的5%3’→5’外切酶活性无5'→3'外切酶活性。可能在DNA的修复中起某中作用。

3.DNA聚合酶III寡聚酶，异二聚体，10-20个/cell，但催化的速度很快。目前认为是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶。全酶由多个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶，

DNA多聚酶Ⅲ的结构夹子装置器全酶在DNA上的装配分为三个阶段：（1）一个β二聚体加上一个γ复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA在于β,γ复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与DNA结合。（3）τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。4.三种DNA聚合酶的结构和功能大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（复合物）109，000400+++

120，000100++-

400，00010-20+++

比较项目

★DNA聚合酶有6个结合位点⑴模板DNA结合位点⑵引物结合位点⑶引物3’-OH位点、反应位点⑷底物dNTP结合位点⑸5’→3’外切位点(pol.Ⅱ没有

⑹

3’5’外切位点子链DNA延伸方向为什么只能是5’3’？已知的DNA聚合酶只能使链按5’－3’方向生长5’

OHTCATCAC

5’

OH3’ppp

OHC++

ppi

进化中保留的深刻的选择与适应的、化学及功能的根源

如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

GATCG

5’pppOH3’ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOHG

5’pppa、因能量的需要，DNA的5’

端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl

的生理环境中，使dNTP难以聚合到DNA的5’端

需要其他机制以解脱b、碱基发生错配后的校正……

费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗

ATCG

pppOH+

pppAp

OHTCGpppOHTCGTCGpppOH（二）解螺旋酶与单链DNA结合蛋白

1.解旋酶利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链.与rep蛋白协同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶沿着后随链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5’方向移动。解旋酶(helicase)2.单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称为双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177个aa组成在E.coli

中以四聚存在分子量为74KDa作用与特点：1).能够与单链DNA结合，降低天然DNA的Tm2).稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA。3).保护单链，DNA避免核酸酶的降解。4).蛋白质之间表现出协同性，第一个SSB

结合促进了后续SSB与单链DNA分子的结合，直至全部单链DNA分子被SSB所覆盖。但真核生物的SSB没有此特点。（三）.DNA旋转酶WP420属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物，既能水解，又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。

DNA双链重新连接DNA双链穿过DNA的释放重复起始DNA双链断裂拓扑异构酶II的作用机制WP34-19（四）引物合成酶(Primase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物，以提供自由的3’-OH，使子代DNA链能够开始聚合。5´3´5´3´5´

5´RNAprimer（五）

DNA连接酶（ligase）WP417催化两段DNA之间的连接

a、切刻的3’－OH和5’－P相邻。

b、切刻各自碱基处于配对状态基础上双链中的单链缺口。

c.需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）

d.只连Nick，不连Gap。

作用机制是分三步进行：1、E＋ATP→E－AMP＋ppi

在E.coli中，

E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸）2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化3、活化的5’－PO4与相邻的3’－OH作用形成3‘－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。二.DNA复制的机制

（一）半不连续性和冈崎片段

1.半不连续复制：DNA聚合酶催化的方向是5’→3’。DNA的一条链是

3’→5’，以这条链为模板，合成的方向5’→3’随复制叉的移动能连续合成，称为领头链或先导连；以DNA的另一条链是5’→3’为模板，由于聚合方向是5’→3’，因此随复制叉的移动不能连续合成，称随从链或滞后链。

冈崎片段与半不连续复制（okazaki1968年）2.冈崎片段：

冈崎用电子显微镜看到了DNA复制过程中出现一些不连续片段，这些不连续片段只存在于DNA复制叉上其中的一股。后来就把这些不连续的片段称为冈崎片段。1968年，发现冈崎片段。细菌：1Kb-2Kb真核：100-200bp（二）.复制过程

1.复制的起始★大肠杆菌起始复制所需蛋白质：WP422表34-4DNaA

在原点处打开双螺旋DNaB

使DNA解旋，活化引物合成酶DNaC

DNaB结合在原点所需HuDNA结合蛋白，刺激起始引物合成酶（DNaG）合成RNA引物SSB结合单链DNARNA聚合酶促进DNaA的活性旋转酶松驰DNA扭曲张力（1）引物合成酶和引发体

细胞内，DNA的复制需要RNA引物，引物合成酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引物。★DNA复制为什么要用RNA引物？⑴DNA聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。⑵从模板复制最初几个核酸时，碱基堆积力和氢键都较弱，易发生错配。没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的3’→5’校对功能难发挥作用。引物合成酶：

RNA聚合酶DnaG

引发：当DNA的双螺旋解开后，合成

RNA引物的过程。引发体（dnaB、dnaC、n、n”n’I）由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物合成酶一起组装形成引发体。引发体沿着模板链5’→3’方向移动（与复制叉移动的方向相同）。

WP424

zP45复制起始区的结构特点是：（1）富含A－T，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（9－14个GATC）

11个GATC较保守,GATC中的“A”已甲基化;（3）具有4个串联的9个碱基反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。首先，DnaA（携ATP）与Ori处的识别位点（9bp重复序列）紧密结合，形成起始复合物；Hu蛋白通过与DNA结合，使之弯曲，使DnaA与A－T富含区相接触，使其解链，形成开放复合物；单链结合蛋白（SSB）与解开的单链结合。DnaA还能指导DnaB－DnaC复合物结合到解链区形成前引发复合物，DnaC的功能是运送DnaB蛋白，DnaB具螺旋酶活性，使螺旋解旋，暴露出引物形成位点，DnaB同时引导引物合成酶的结合形成引发体，合成RNA引物。结合Ori区，具ATP酶活性促进DnaB形成起始复合物

DNA解螺旋酶运输DnaBDNA引物合成酶促进起始复合物形成（2）复制起始：WP421

ZP45

简单步骤：

*

转录激活*DnaA

识别并结合复制起点，DnaB－DnaC

六聚体与oriC

形成预引发体

*

DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA*引物合成后，DNApol

组装到引发的RNA

上，完成复制体的组装DNA聚合酶Ⅲ识别复制起点并附着上去，由其β亚单位辨认引物，新链的第一个脱氧核苷酸与引物的3-OH形成磷酸二酯键，开始复制。

拓扑异构酶松弛螺旋。

后续研究发现：

♦

细菌中先导链的合成受转录抑制剂的抑制♦

后随链的合成不受转录抑制剂限制原因：

♫

先导链的起始需要RNApol的转录激活

♫

而后随链的起始由引发酶（引物合成酶）合成引物，而引发酶不受转录抑制剂的抑制

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物合成酶SSB3535引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物合成酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

2.DNA链的延长

复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNApol.Ⅲ催化。实验证据：Reiji等的实验证据－－每一冈崎片段都产生一个RNA－DNA接头AOHPOHXP＊HYP＊H甲苯处理E.coli培养于标记的dNTP和未标记的NTP中分离DNA用稀碱处理，发现片断末端有放射性标记。RNADNA碱性水解发生在3’，5’－磷酸二酯键的磷酸基与C－5’之间，因此，

［32P］转移到了核苷酸上去。H引发一旦完成，DNA聚合酶就在RNA引物的3’－OH端按照模板链的碱基顺序，以碱基互补的规则延伸DNA链。无论原核还是真核生物，前导链是按5’3’方向连续合成，后随链的延伸也是按53’，但不是连续合成，而是先合成多个RNA引物，再延伸为多个冈崎片段，最后连接起来。

E-coli前导链和后随链的合成都是由DNApolⅢ

催化。WP423后随链的模板折迭180。成环状点绕在DNApolⅢ的一个催化亚基上，使后随链合成的方向与前导链平行，前导链和后随链3’－末端的生长点都靠近于催化亚基，二条链的合成都在DNApolⅢ的催化下同时进行。DNA聚合酶III二聚体模型不对称的结构表明了所示的复制叉的结构。一个催化核心和每一条DNA模版链结合。全酶沿着模版在前导链上连续的滑动；而后随链的模版需要被穿过，DNA上形成了一个环。DnaB创造了一个解旋点，并且沿着DNA向“前方”（沿着模版后随链上5’-3’的方向）滑动。聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白（SSB）在一个冈崎片段初始化之后，后随链的核心复合物在合成一条新链的时候将单链模版从β夹板中拉过。当冈崎片段合成完毕后脱落，释放环.在下一个初始位点,核心复合物（或者很可能是同一个核心复合物）会和β夹板结合开始新的一个片断的合成。DnaB是推动复制叉前进的解旋酶,同时当它和DnaG引发酶反应的时候又会形成引发体，这是他的双重特性。当引发体在合适的位点形成后，引物合成开始，然后引发酶被释放。引物RNA的长度通常在8-14个碱基之间。很显然，DNA聚合酶III负责替代引发酶。（3）复制终止WP424

环状DNA，复制叉相遇即终止。线性DNA,有特定的终止序列。

1、环形DNA复制的终止环状DNA复制时，可在离起始点180。相遇，即两个复制叉同时到达一个部位。环状双链DNA复制终止后，两个子代DNA分子互相绞链在一起，不能立即分开，需要借助拓扑异构酶在其中一条DNA链上打开缺口，使两个子代DNA分子分离，然后再把缺口连接起来。OriginTerminusDaughterDNA

structure有些环状DNA分子内含有终止位点，一个复制叉先到达该处停下来，然后另一个复制叉也到达该部位。如E-coliDNA中有二个终止位点（T1和T2），T1使反时针方向移动的复制叉终止，T2使顺时针方向移动的复制叉终止。Tus蛋白识别T1和T2位点，并与之结合，可能阻止DnaB（螺旋酶）的解链作用，阻碍复制叉的前进。它是E-coli复制终止所必需的因子，但终止子不是必需的。A.终止序列：

T1序列：terE

terD

terAT2序列：terF

terB

terC每个区域只对一个方向的复制叉起作用

B.专一性终止蛋白

E.coli

中由Tusgene编码（terminusutilizationsubstance）通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用.ter两复制叉相遇处大约50-100bp未被复制。线性DNA复制时，当复制叉到达分子末端时，复制即终止，两个子代DNA分子自行分开。有实验证实，酵母细胞染色体复制完成后，也需要TopoⅡ的作用才能使子代DNA分开。4、RNA引物的切除与缺口的填补DNApolⅠ的5’→3，外切活力（或RNaseH)，切除RNA引物。DNApolⅠ的5’→3，合成活性补齐缺口。

DNA连接酶：催化相邻的双链片断的连接

小结：⑴DNA解螺旋酶解开双链DNA。⑵SSB结合于DNA单链。⑶DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。⑷DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。⑸DNApol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。⑹DNApolⅠ切除RNA引物，并补上DNA。⑺DNA连接酶连接一个个冈崎片段。

DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力不是很高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNApolⅠ、DNAligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。(三）复制的忠实性

a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，错配率为

10-9-10-10）

b、DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）

c、起始时以RNA作为引物，减少了错配

。(RNA引物最终被降解而避免最终避免由于最初几个核苷酸的复制错误导致的致死突变!）第二节.真核细胞的DNA复制多个起点复制起点起点起点起点起点起点果蝇5000replicons

平均40Kb（酵母）哺乳动物平均100Kb

一.真核细胞的DNA聚合酶

WP424ZP48

DNA聚合酶αDNA聚合酶δDNA聚合酶γDNA聚合酶β、DNA聚合酶ε-参与引物的合成-参与前导链、后随连的合成-参与线粒体DNA的合成-参与DNA的修复-参与后随连的合成1.真核生物DNA聚合酶⑴DNA聚合酶α:多亚基，有引物合成酶的活性、聚合酶的活性，无外切酶活性。⑵DNA聚合酶β:主要在DNA损伤的修复

中起作用。⑶DNA聚合酶γ:从线粒体得到，可能与

线粒体DNA的复制有关。⑷DNA聚合酶δ:持续合成DNA,有3’→5’外切活力,真核DNA的复制酶。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。二.真核生物复制过程中的核小体结构核小体的结构（200bp左右）在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。

αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能复制、引发修复复制复制复制

αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能复制、引发修复复制复制复制

αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能复制、引发修复复制复制复制

αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－+－

功能复制、引发修复复制延长链复制，解螺旋酶活性修复

ε

δ真核生物DNA的复制WP426

ZP49（1）组蛋白的合成在细胞核中与DNA复制同步进行（2）组蛋白八聚体在DNA复制时并不离开亲本DNA链。（3）组蛋白八聚体以全保留方式传给子代（4）组蛋白八聚体先与前导链结合。

放线菌酮cycloheximideA.蛋白质合成抑制剂（放线菌酮）抑制实验

组蛋白八聚体以全保留方式传给子代组蛋白八聚体先与导链结合。新老八聚体在子代链上的分布复制原点老新先导链后随链

DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清。端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。形式为：5’（TxGy）n，3’(AxCy)n，x和y一般为1-4。

TG常比AC链长，形成3’单链末端。

TTTTGGGGTTTTGGGG…三.端粒的复制端粒末端的重复序列，通过端粒酶将其加到染色体末端。端粒酶含有RNA和蛋白质合酶两种组分，RNA分子约150bp，含有多个CyAx重复序列，RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。端粒合成的一种模型

3´5´TTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3´5´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3´5´AATTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和杂交移位和再杂交继续延伸WP426DNA聚合酶复制子链进一步加工非标准G-G配对回折

人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端粒酶表达多。端粒酶抑制剂-抗癌治疗的新靶点。细胞分裂细胞分裂细胞衰老端粒酶永生化抗肿瘤靶点抗衰老

端粒酶重新引入a、复制子的大小:EukaryoticDNA: 平均100kbProkaryoticDNA: >1000kbb、冈崎片段

EukaryoticDNA: 100-200bpProkaryoticDNA:1000-2000bpc、复制速度

EukaryoticDNA: 3,000bp/minProkaryoticDNA: 50,000bp/min原核生物和真核生物DNA复制的比较1.Semi-conservativereplication2.Semi-discontinuousrepliction3.DNAhelicase,SSB4.RNApriming5.校正阅读（Proofreading）1.复制起点（单、多）2.复制子（大小、多少）3.复制叉移动的速度(900/50nt/S)4.冈崎片段的大小5.端粒和端粒酶6.DNA聚合酶Polymerases相同点：不同点：三.真核和原核DNA细胞复制比较第三节.逆转录作用WP493

ReverseTranscription1、概念

以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。RNADNA

逆转录酶2、逆转录酶

(reversetranscriptase)

三种功能依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力依赖RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H活力模板：RNA或DNA

以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。引物：RNA或DNA底物：dNTP二价阳离子：Mg2+或Mn2+逆转录过程中cDNA的合成

依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶前病毒负链正链3.反转录过程

当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时，病毒RNA及反转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的反转录酶使RNA反转录成双链DNA。以病毒RNA为模板，合成互补的（-）DNA。核糖核苷酸酶H专一切除切除RNA—DNA杂种分子中的RNA。以（-）DNA链为模板，合成（+）DNA链,成为cDNA。反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA后,才具有侵染性。前病毒DNA进行复制,用其负链(依赖DNA的RNA聚合酶)转录出功能基因RNA、基因组RNA，合成病毒蛋白。

基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。逆逆转录病毒的生活周期生活周期RNA衣壳被膜逆转录酶转录转译整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞丢失被膜丢失衣壳逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋白被膜蛋白逆转录酶互补的DNA第四节DNA的损伤及修复

WP427ZP51一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。一.损伤的两种类型：1.单个碱基改变影响DNA序列但不改变DNA的整体结构。ZP54图2-30

当DNA双链被分开时不影响转录或复制。所以这些改变通过DNA序列变化的后果对更多的世代产生破坏作用。这种影响是由于一个碱基转变成了另一个碱基，而此碱基不能与原互补碱基正常配对。

如胞嘧啶脱氨基作用(自发地或化学诱变剂)产生一个错配的U·G对；而一个复制错误即插入腺嘌呤代替胞嘧啶从而产生一个A·U对。通过在一个碱基上共价添加一个小基团从而改变其碱基配对也能产生相似的结果。这些改变可以导致非常小的结构扭曲(像U·G对的例子)或非常明显的改变(象A·G对的例子)，但是共同的特征是这种错配在下一次复制前就结束了。2.结构扭曲产生物理性的损伤。

DNA一条链上碱基之间或相对链上碱基之间的共价连接能够抑制复制和转录。研究最多的例子是紫外线照射效应，该效应能在两个毗邻的胸腺嘧啶碱基之间引入共价键，产生图中的链内嘧啶二聚体。在一个碱基上添加一个巨大的加合物破坏双螺旋结构也可产生相似结果。紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT），两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体（CT、CC），使复制、转录受阻。目前已知有5种酶修复系统：

光复活校正修复切除修复重组修复

SOS反应后四种不需要光，又称为暗修复一.光复活（直接修复）

WP428

1949年已发现光复活现象，可见光（最有效400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。

P252图12-13紫外线损伤的光复活过程

NNCH3OORHPHROOCH3NNNNCH3OORHHNNCH3OORPUVTT光复活酶

1.形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放DNA紫外线损伤的光修复二.切除修复ZP53WP429在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。1.结构缺陷的修复（核苷酸切除修复）：ZP53（1）核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。（2）核酸外切酶切除损伤的DNA。（3）DNA聚合酶修复。（4）DNA连接酶连接。2.E.coli切除修复的uvr系统包括3个基因：uvrA

，B，C，编码一个修复核酸内切酶的成分。（1)UvrAB组分识别嘧啶二聚体和其他较大的损伤。然后UvrA解离(需要ATP)，（2）UvrC

与UvrB

结合。UvrBC

重组使损伤两边都产生一个切口，UvrC

在损伤5’端的第8个核苷酸处切开，UvrB

在3’端的第5个核苷酸处切开，需要ATP。切除的DNA长度平均约为12-13个核苷酸，（人类切除的DNA长度27-29个）。

UvrD

是一个解旋酶，能使DNA解旋以释放两个切口之间的单链。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。DNA连接酶ATPE.coli的切除修复机制DNA聚合酶ε真核2.无嘌呤无嘧啶修复(碱基切除修复)

甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷键，造成脱嘌呤作用；酸也能使DNA脱嘌呤。

DNA复制时，DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP掺入DNA链。细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉次黄嘌呤。对于无嘌呤无嘧啶位点（AP位点）的损伤的修复方法：

AP核酸内切酶切开，核酸外切酶切除包括AP位点核苷酸在内的小片断DNA，DNA聚合酶I修复合成新片断，DNA连接酶连接。DNA的损伤和切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶AP核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复连接糖苷酶三.重组修复切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重组修复。并非完全校正。重组修复至少需要4种酶组分。重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。DNA的重组修复胸腺嘧啶二聚体复制核酸酶及重组蛋白修复复制DNA聚合酶DNA连接酶重组

四.错配修复（校读作用）

WP428ZP52如果修复的目标是由于突变产生的一个正常碱基的错误配对碱基，那就会引出一个问题：修复系统本身并不知道哪个是野生型碱基哪个是突变体！它所看到的只是两个不合适配对的碱基，两个碱基中的一个是切除修复的靶位。5-甲基胞嘧啶脱氨基作用变成胸腺嘧啶后，由一个特殊的系统可以恢复其正确的序列。脱氨基作用产生了一个G·T对，修复系统偏向于其变为G·C对(而不是A·T)。VSP系统负责这种反应，它包括可以从G·T中去除T的mutL

、S系统。当大肠杆菌复制过程中发生错配时，区别原始DNA链是可行的。dam基因编码腺嘌呤甲基化酶，此酶负责5’GATC序列中A的甲基化。DNA在复制起始时几秒钟，母链就会甲基化，刚结束时，只有原始亲本链带有甲基。在刚合成的链等待引进甲基期间的半甲基状态可用于区分模板链和原始链。修复机制1）MutS二聚体特异性地识别并结合到错配位点，MutL二聚体与MutS二聚体结合，水解ATP沿DNA链移动，识别GAmTC

序列后，使DNA形成环状。2）MutH核酸内切酶与MutSL复合物结合。然后核酸内切酶切割未甲基化的链，从GATC位点到错配位点之间的序列被切除。3）切除可以按5’-3’方向进行(利用RecJ或内切核酸酶VII)，也可以按3’-5’方向进行(利用内切核酸酶I或内切核酸酶X)，解旋酶进行辅助。4）链的切除可达1000个核苷酸以上，新链是由DNA聚合酶III合成的，DNA连接酶连接完成。五.诱导修复和应急反应（SOS反应）

WP431ZP55★诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复，称ＳＯＳ修复。50年代，Weigle发现如果将经UV照射的λ噬菌体感染经UV轻度照射的E.coli可以看到噬菌体的存活数和突变型都比感染不经UV照射的E.coli为高(W-效应）。这一事实说明经UV轻度照射的E.coli细胞中诱导出现一种对于噬菌体DNA损伤修复的功能，可是在修复的过程中却带来了基因突变。（w-诱变效应）

★SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（无差错修复）和倾向差错的修复。★避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活、切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活、切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。★倾向差错的修复：

SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶(DNA聚合酶IV和V)

，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向差错的修复。1.SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。

RecA蛋白不仅在同源重组中起重要作用，而且它也是SOS反应的最初发动因子。在有单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活而表现出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌体的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）许多基因的阻遏物，

当它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶的亚基）以及recA和lexA基因本身，还有单链结合蛋白基因ssb，与λ噬菌体DNA整合有关的基因himA、与诱变作用有关的基因umuDC、dinB(分别编码DNApolV、DNApolIV)，与细胞分裂有关的基因sulA，ruv。2.SOS反应过程：1）诱导前:LexA阻遏蛋白,RecA蛋白可少量的合成.2）诱导：X-射线，紫外线，烷化剂，黄曲霉素等造成DNA损伤，（单链DNA是诱导信号，使RecA蛋白激活，并结合上去，分解LexA阻遏蛋白和λ阻遏蛋白，使与SOS有关的基因转录，合成蛋白，进行SOS修复。3）诱导状态：修复基因uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶的亚基，加强切除修复，sulA细胞分裂有关。4）恢复状态:由于修复使原有信号消失，诱导物不再存在，RecA蛋白重新回到不激活状态SOS反映有关的基因又被阻遏。SOS反应的机制未诱导的细胞靶基因lexA基因被LexA

蛋白质部分阻遏recA基因被LexA

蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）LexA(阻遏物)

RecA(辅蛋白酶)靶基因表达lexA靶基因表达

但产物被分解recA大量表达RecA促使分解LexA诱导的细胞单链DNAATP3.SOS反应与细胞分裂4.SOS反应与DNA复制：两种特殊形式的复制

A.依赖于发生变化的DNA聚合酶(无3’5’

的外切酶活力）的复制突变酶引入非配对碱基的量是正常酶的10倍。产生变异。

B.不依赖于蛋白质合成而发动的DNA复制

SOS诱导物能使复制体解体的酶不出现或通过激发RecA蛋白分解这种酶。5.SOS修复的生理意义：

DNA修复、导致变异SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。然而癌变有可能也是通过SOS反应造成的，因为能引起SOS反应的作用剂通常都具有致癌作用，如X-射线，紫外线，烷化剂，黄曲霉素等，这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

第五节.基因突变一.突变的概念○基因突变（genemutation）：是指一个基因内部可以遗传的结构改变，是基因分子内部在某种条件作用下所发生的一个或几个核苷酸的改变，导致结构蛋白或酶的改变，从而影响有机体的大小、品质、颜色、结构和生长率等性状的改变。基因突变一般在染色体结构上是看不到的，所以又称点突变（pointmutation）。○突变体（mutant）或称突变型：由于基因突变而表现突变性状的细胞或个体。

维多利亚女王与尼古拉二世

英国女王维多利亚。她带有血友病的基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。

突变的类型（一）自发突变★在自然状况产生的突变

1.在DNA复制中造成错误

1）错义突变（误义突变）——指DNA分子中碱基的替换，使蛋白质分子中某一种氨基酸转换为另一种氨基酸的突变类型。碱基替换有两种类型：转换：一个嘧啶碱取代另一个嘧啶碱，或一个嘌呤碱取代另一个嘌呤碱，这种置换方式称为转换。颠换：一个嘧啶碱取代另一个嘌呤碱，或一个嘌呤碱取代另一个嘧啶碱，这种置换方式称为颠换。例如人的正常血红蛋白（HbA）变成廉形红细胞贫血（HbS）以及地中海贫血（HbC），到人的血红蛋白的β链的第六位氨基酸一个碱基改变引起的基因突变。

1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。

2）移码突变在DNA链中插入或缺失一个或几个碱基引起阅读框改变，造成氨基酸改变或终止密码子位置改变。3）无义突变（nonsensemutation）：是指由于突变而使其某一编码子突变为终止密码子（UGA,UAG，UGG）。4）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从

DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失或插入都可导致框移突变。谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突变重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

2自发损伤自然产生的对DNA的损伤引起的基因突变。（1）脱嘌呤：碱基和脱氧核糖间的糖苷键受损，引起一个嘌呤从DNA上脱落。（2）脱氨基：胞嘧啶脱氨基后变为尿嘧啶，形成G-C对变为A-T对。（3）氧化性损伤碱基：活泼氧化物对DNA本身的氧化损伤，也能引起突变。

H

HA

H

C

CT

T

A

G

T

C氧化（二）、诱发突变1.物理因素诱变只限于各种电离辐射和非电离辐射1）电离辐射诱变

包括射线、射线和中子等粒子辐射，还包括r射线和射线等电磁波辐射。中子的诱变效果最好。2.化学因素诱变

1)简史

1941年第一次发现芥子气可以诱发基因突变。

1943年第一次发现氨基甲酸乙酯(NH2COO2H5）可以诱发染色体结构的变异

2)化学诱变的特点某些化学药物的诱变作用是有特异性的，即一定性质的药物能够诱发一定类型的变异。化学因素3）化诱物质的种类与作用机理

A.烷化剂：甲基磺酸乙酯[EMS，CH3