生化工艺第三章培养基的选择与灭菌

第六节

培养基的灭菌方法及原理问题1在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？P491、由于杂菌的污染，使生物反应中的培养物质因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化特性，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化；4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等。1、培养基如何分类？在发酵生产中常用的固体还是液体培养基？2、说说培养基的六大营养要素？复习根据培养基的用途(特殊用途)不同，可将培养基分成：孢子\种子\发酵

增殖、选择和鉴别培养基

根据培养基状态不同，可将培养基分成：

固体、液体和半固体培养基

根据营养物质的来源不同，培养基可分为：

天然培养基、合成培养基和半合成培养基

当前1页，总共41页。一、灭菌的方法

问题2为防止杂菌的污染，整个生化生产过程哪些需要注意灭菌？消毒与灭菌的区别？

消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和酿酒原汗等的巴氏消毒法，是将物料加热至60℃维持30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。

灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。

消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。

培养基、发酵设备、空气、菌种制作基本概念当前2页，总共41页。控制有害微生物主要有以下几种措施

当前3页，总共41页。1、灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。当前4页，总共41页。当前5页，总共41页。2、消毒（disinfection）从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的“毒害”就是指传染源或致病菌的意思，英文中的“dis-infection”也是“消除传染”的意思。所以，消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。当前6页，总共41页。3、防腐（antisepsis）防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。（1）低温（2）缺氧（3）干燥

（4）高渗

（5）高酸度

（6）防腐剂当前7页，总共41页。4、化疗（chemotherapy）化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。

当前8页，总共41页。1、化学试剂灭菌法化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒2、射线灭菌法3、干热灭菌法电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h适用范围：金属或玻璃器皿当前9页，总共41页。4、湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121℃，30min适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌

例：高压灭菌锅5、过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气6、火焰灭菌法火焰适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口酒精灯当前10页，总共41页。灭菌方法连线题接种针、试管口环境空气、皮肤表面无菌室、接种箱培养基的灭菌空气过滤除菌法火焰灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法化学试剂灭菌法比较各种微生物对热的抵抗能力大小营养细胞、芽孢、病毒或孢子当前11页，总共41页。二、湿热灭菌原理湿热灭菌原理P50灭菌条件灭菌不利方面由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热(潜热)，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。121℃，30min。同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因为，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失当前12页，总共41页。1、衡量热灭菌指标P51

热死时间：即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。P51表3－15和3－16热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。表3-17列出了某些微生物的相对热阻。

灭菌方式大肠杆菌霉菌孢子细菌芽孢噬菌体或病毒干热灭菌12-1010001湿热灭菌12-103×1051-5苯酚11-21×10930甲醛12-102502紫外线15-1002-55-10当前13页，总共41页。从表中可看出

芽孢或孢子的热阻要比生长期营养细胞的热阻大得多，这是由于芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对热阻的增加有关。另外，芽孢子中蛋白质含水量较营养细胞低（特别是游离水分少），也是芽孢耐热强的一个原因。图3-3和图3-4分别为大肠杆菌营养细胞和FS7954芽孢杆菌的芽孢在不同温度下的死亡情况。

10t(min)N/N0大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线10-110-210-310-42468106058565410t(min)N/N0嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线10-110-210-310-4510152025121116110108105从表中可看出问题说说芽孢或孢子的热阻要比营养细胞的热阻大的原因？当前14页，总共41页。比较热阻大小营养细胞、芽孢、病毒或孢子说说工业化生产中广泛使用湿热灭菌法优缺点？问题当前15页，总共41页。当前16页，总共41页。受热时间如何确定？在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。当前17页，总共41页。2、微生物的死亡速率：对数残留定律P52

微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。

在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，

当前18页，总共41页。式中，N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。积分得：

式中：N0—开始灭菌（t=0）时原有活菌数；Nt----经时间t后残存活菌数。微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比

上式是计算灭菌的基本公式，灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的，K值愈小，则此微生物愈耐热。当前19页，总共41页。10t(min)N/N0大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线10-110-210-310-424681060嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线58565410t(min)N/N010-110-210-310-4510152025121116110108105从表中可看出问题在121度，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的K值为0.03s-1，请问哪一种微生物更耐热？1）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈现非对数死亡定律;2)培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性；高浓度盐类、色素能削减其耐热性;3）工程上，在进行灭菌的设计时，常认为N/N0=0.001，即在1000次灭菌中，允许有一次失败;4)同一种微生物在不同的灭菌温度下，k值不同，灭菌温度愈低，k值愈小；温度愈高，k值愈大。注：从上述的微生物对数死亡规律和非对数死亡动力学模型方程式可知，如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则灭菌所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。当前20页，总共41页。3、灭菌温度和时间的选择微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：A---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---绝对温度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数.上面说过，当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏，那么有何良策可以既达到灭菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分呢？实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏，如在121℃，仅20min，就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的破坏尽可能养活的灭菌工艺条件。当前21页，总共41页。灭菌时，培养基成分分解速率常数K`与温度之间的关系也可用阿累尼乌斯公式表示：K`---培养基内易被破坏成分的分解速率常数；A`---频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1；R---气体常数，8.314J/mol·K；T---绝对温度，K；ΔE`---培养基成分分解所需活化能，J/mol。

当培养基成分从T1上升到T2时，微生物的死亡速率与培养基的分解有如下关系：从上式可知，K值的大小与微生物的种类与加热温度有关当前22页，总共41页。通过实验测定可知：

灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值，因此：即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。也就是说，结论1：当灭菌温度上升时，微生物死亡速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。据测定，每升高10℃时一般化学反应的反应速率的增加倍数是1.5-2.0，而杀死芽孢为5-10，杀死微生物细胞为35左右。。当前23页，总共41页。

由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。

灭菌温度℃灭菌时间（分）营养成分破坏量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0

表3-21灭菌温度、时间与营养成分破坏量的关系（N/No=0.001）

当前24页，总共41页。问题灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118℃灭菌15min，另一种是128℃灭菌5min。哪一种方法好，为什么？答：从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。

因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。当前25页，总共41页。第七节培养基的湿热灭菌方式及灭菌时间的计算1、间歇灭菌（分批灭菌、实消）P56定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。（常用）24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。

各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%图为培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况。1）基本概念一、培养基的湿热灭菌方式当前26页，总共41页。

在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时可以适当延长灭菌时间。生产上甚至有用100℃蒸煮而达到彻底灭菌的实例。如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽蒸30min，杀死其中的营养细胞，但孢子与细菌的芽孢没有被杀死。将蒸过的原料置于室温下过夜，未被杀死的孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。

从以上分析可知，灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不计。此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。问题

在实际生产中，如果遇到所供蒸汽不足，如何有用100℃蒸煮而达到彻底灭菌？家用土蒸锅对食用菌三级种进行灭菌当前27页，总共41页。2）间歇灭菌的操作间歇灭歇是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到70左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120℃，罐压为1*105Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。由于培养基的间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂经常采用的一种培养基灭菌方法。

当前28页，总共41页。2、连续灭菌（连消）P57

1）定义：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。左图为连续灭菌过程中温度的变化情况。由图可以看出，连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地被冷却，因此可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌，而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短，极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。当前29页，总共41页。发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵加热塔维持罐冷却管

连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50后，输送到预先已经灭菌过的罐内。当前30页，总共41页。喷射加热连续灭菌流程灭菌介质原料介质蒸汽T=140度保温段真空

流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。分别说出优点当前31页，总共41页。薄板换热器连续灭菌流程进料35℃100℃120℃维持罐120℃蒸汽147℃120℃55℃出料35℃水20℃31℃流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。

分别说出优点当前32页，总共41页。3、间歇灭菌与连续灭菌的比较

间歇灭菌或连续灭菌都有各自的优点和缺点，现比较如下：灭菌方式优点缺点连续灭菌1.

灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失2.

操作条件恒定，灭菌质量稳定3.

易于实现管道化和自控操作4.

避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率5.

发酵设备利用率高1.

对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置2.

操作较麻烦3.

染菌的机会较多4.

不适合于含大量固体物料的灭菌5.

对蒸汽的要求高间歇灭菌1.

设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置2.

操作要求低，适于手动操作3.

适合于小批量生产规模4.

适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌1.

培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降2.

需进行反复的加热和冷却，能耗较高3.

不适合于大规模生产过程的灭菌4.

发酵罐的利用率较低加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。当前33页，总共41页。二、灭菌时间计算与影响因素

A、分批灭菌（实罐灭菌）

一般可以不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简单地利用式5-4，粗略地求得灭菌所需的时间1、培养基灭菌时间的计算当前34页，总共41页。例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL