分子生物学实验原理与常见问题解答

RNA提取原理与注意事项PCR原理与常见问题Real-timePCR介绍内容现在是1页\一共有51页\编辑于星期三商品化提取试剂盒原理：

异硫氰酸胍（GIT）-酚法

GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一定条件下（各家试剂条件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通过滤柱时，RNA挂柱，DNA和蛋白质溶于滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯化；最后用水洗脱。现在是2页\一共有51页\编辑于星期三杜绝外源酶的污染：严格戴好帽子，口罩，手套。实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。RNA提取的注意事项（外界环境中多含Rnase，且RNA极不稳定）RNasefreeDNasefree现在是3页\一共有51页\编辑于星期三阻止内源酶的活性：

选择合适的匀浆方法。选择合适的裂解液。控制好样品的起始量。现在是4页\一共有51页\编辑于星期三RNA提取原理与注意事项PCR原理与常见问题Real-timePCR现在是5页\一共有51页\编辑于星期三PCR技术的基本原理模板DNA的变性：93℃-95℃左右，模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5℃引物的延伸：TaqDNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性变性--退火--延伸三个步骤

现在是6页\一共有51页\编辑于星期三引物的复性温度

通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合现在是7页\一共有51页\编辑于星期三1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍现在是8页\一共有51页\编辑于星期三模板DNA95℃现在是9页\一共有51页\编辑于星期三PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物现在是10页\一共有51页\编辑于星期三PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶现在是11页\一共有51页\编辑于星期三PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始现在是12页\一共有51页\编辑于星期三PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq现在是13页\一共有51页\编辑于星期三PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束现在是14页\一共有51页\编辑于星期三PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

现在是15页\一共有51页\编辑于星期三标准的PCR反应体系（100ul体系）10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul现在是16页\一共有51页\编辑于星期三PCR反应五要素模板（template）引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）Mg2+（magnesium）现在是17页\一共有51页\编辑于星期三（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。现在是18页\一共有51页\编辑于星期三（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。现在是19页\一共有51页\编辑于星期三（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。现在是20页\一共有51页\编辑于星期三（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。现在是21页\一共有51页\编辑于星期三EB染色原理：

EB插入DNA碱基对之间的结合现在是22页\一共有51页\编辑于星期三PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性现在是23页\一共有51页\编辑于星期三无扩增产物现象：阳对照有条带，而样品则无M样品A样品B阳性对照现在是24页\一共有51页\编辑于星期三纯度：含有抑制物浓度：含量低质量：RNA被降解操作：体系配制有误，模板加入有误

原因纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板RNA加大模板的用量重新提取RNA，并做好无Rnase前处理重新配置扩增体系，重新PCR对策现在是25页\一共有51页\编辑于星期三

非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。现在是26页\一共有51页\编辑于星期三引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数对策现在是27页\一共有51页\编辑于星期三现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

M12现在是28页\一共有51页\编辑于星期三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数对策现在是29页\一共有51页\编辑于星期三靶序列或扩增产物的交叉污染

原因开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外更换试剂、耗材试剂分装，贮存适当。更换实验室和所有试剂耗材。假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物对策现在是30页\一共有51页\编辑于星期三PCR中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分现在是31页\一共有51页\编辑于星期三Real-timePCR技术介绍现在是32页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法现在是33页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析现在是34页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析现在是35页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件现在是36页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值现在是37页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value现在是38页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定，误差大；Ct值则极具重现性起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR放大，并非研究所期望的数据现在是39页\一共有51页\编辑于星期三非特异性荧光标记：1、SYBRGreenⅠ特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon实时荧光定量PCR的几种方法介绍

现在是40页\一共有51页\编辑于星期三－SYBRGreenⅠ法现在是41页\一共有51页\编辑于星期三SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreenⅠ只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreenⅠ发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBRGreen现在是42页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation现在是43页\一共有51页\编辑于星期三实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度现在是44页\一共有51页\编辑于星期三--TaqMan法现在是45页\一共有51页\编辑于星期三与目标序列互补TaqMan---水解型杂交探针

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)