生物化学教学课件：第三章 蛋白质

第三章蛋白质一、什么是蛋白质?蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由20种左右天然а-氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物；其种类繁多，具有一定的相对分子量、复杂分子结构和特定生物学功能；是表达生物遗传形状的一类主要物质。二、蛋白质在生命中的重要性

恩格斯曾指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”

第一，蛋白体是生命的物质基础；

第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。三、蛋白质具有重要的生物学功能1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质蛋白质占干重人体中（中年人）

人体45%水55%

细菌50%∼80%蛋白质19%

真菌14%∼52%脂肪19%

酵母菌14%∼50%糖类＜1%

白地菌50%无机盐7%2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者，它参与了几乎所有的生命活动过程1）酶的催化作用2）生物体的组成成分3）储藏作用4）运输功能5）收缩运动6）激素功能7）免疫保护功能8）接受和传递信息9）控制生长和分化3.外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象I：蛋白质的组成

II：蛋白质的结构与功能III：蛋白质的性质、分离与鉴定I：蛋白质的组成

第一节蛋白质通论一、蛋白质的化学组成C(50~55%)、H(6.9~7.7%)、O(21~24%)、N(15~17.6％)、S(0~3％)有些蛋白质含有少量P(0.4~0.9%)或金属元素Fe(0.4~0.9%)、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还含有I。

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%蛋白质元素组成的特点练习题有5g植物种子，经测定含氮0.06g。问该种子蛋白质含量是多少？（％）答案：（0.06×6.25／5）×100=7.5%二、蛋白质的基本组成单位（一）酸水解

回流煮沸20小时

蛋白质氨基酸

6mol/LHCl优点：产物不消旋得到L-氨基酸缺点：色氨酸完全破坏，丝、苏、天冬酰胺、谷氨酸部分破坏（二）碱水解

回流煮沸10-20小时蛋白质氨基酸

5mol/LNaOH

除色氨酸稳定外其它基本破坏，产物消旋，D、L混合（三）酶水解不完全水解受专一性影响氨基酸是蛋白质的基本结构单元第二节氨基酸--蛋白质的基本结构单位一、氨基酸的结构★除脯氨酸Pro外，其他均具有如下结构通式，属于-氨基酸注意：甘氨酸Gly的R基为H不变部分

可变部分20种标准氨基酸

二、氨基酸的分类1）R为脂肪族基团的氨基酸Gly(G),Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P)2）R为芳香族基团的氨基酸Phe(F),Trp(W)，Tyr(Y)3）R为含硫基团的氨基酸Cys(C),Met(M)4）R为含羟基基团的氨基酸Ser(S),Thr(T)5）R为碱性基团的氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)6）R为酸性基团的氨基酸Asp(D),Glu(E)7）R为含酰胺基团的氨基酸Asn(N),Gln(Q)1、按侧链Ｒ基团的结构分类：1）非极性R基团氨基酸2）极性不带电荷R基团氨基酸3）R基团带负电荷氨基酸4）R基团带正电荷氨基酸2、按Ｒ基团的极性分类：丙、缬、异亮、亮、脯、苯丙、色和甲硫氨酸。（1）非极性R基氨基酸8种(Ala,A)(Val,V)(Leu,L)(Ile,I)(Phe,F)(Trp,W)(Met,M)(Pro,P)（2）极性不带电荷R基氨基酸7种甘、丝、苏、酪、半胱氨酸和门冬、谷氨酰胺

(Ser,S)(Thr,T)(Tyr,Y)(Gly,G)(Asn,N)(Gln,Q)H(Cys,C)（3）带负电荷的R基氨基酸2种酸性氨基酸,R-基有COOH(COO-),pH7时带负电荷。门冬氨酸和谷氨酸(Asp,D)(Glu,E)（4）带正电荷的R基氨基酸3种碱性氨基酸,R-基有NH2(NH3+)，pH7时带正净电荷。赖氨酸(-氨基)、精氨酸(胍基)和组氨酸(咪唑基)(Lys,K)(Arg,R)(His,H)2、不常见的蛋白质氨基酸（稀有氨基酸）

在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸和3,5-二碘酪氨酸等。3、非蛋白质氨基酸还有300多种氨基酸不参与蛋白质组成，它们以游离状态或结合状态存在于细胞或组织中。多为蛋白质氨基酸的衍生物。常作为代谢物前体或中间产物。从营养学角度分类必需氨基酸半必需氨基酸非必需氨基酸必需氨基酸和非必需氨基酸从营养学角度必需氨基酸：人自己不能合成或合成量很少，不能满足人体的需要，必需由食物供给的，包括Ile，Leu，Typ，Thr，Phe，Lys，Met，Val（口诀：一两色素本来淡些）半必需氨基酸：Arg和His（口诀：半斤组）非必需氨基酸：人体自己可以合成，不必由食物供给的氨基酸

二、氨基酸的理化性质

（一）物理性质

无色晶体：各种氨基酸都有特殊的晶形。熔点极高：200-300℃。甜味—甘氨酸；鲜味—谷氨酸的钠盐。甘、丙、脯、苏、赖和精水中溶解度大。脯氨酸溶于有机溶剂。可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（200—400nm）：Tyr/Phe/Trp

原因：共轭双键结构（二）氨基酸的光吸收Tyr275nmPhe257nmTrp280nm蛋白质含量测定280nm

（三）氨基酸的酸碱性质和等电点氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。②不溶于非极性溶剂→极性分子③介电常数高→水溶液中的氨基酸是极性分子pH中性，氨基酸为兼性离子，即-NH3＋和-COO－；带有-COOH和-NH2基团的pH不存在生理条件下，氨基质子化，羧基离子化，成为兼性离子或偶极离子水溶液中或固体状态时氨基酸两性离子形式存在。实际存在形式两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有等量的正负两种电荷，由于正负电荷相互中和而呈电中性，这种形式又称兼性离子或偶极离子。

OH-H+

OH-H+氨基酸的两性解离情况如下：酸性中的状态R+中性中的状态R0碱性中的状态R-CHCOOHRNH3+CHCOOHHNH3+CHNH3+COO-RCHNH3+COO-HCHNH2COO-RCHNH2COO-H氨基酸的等电点pI当溶液为某pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0，这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI

。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。pH＜pIpH=pIpH＞pI

从上图可知：氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境中，主要以阴离子的形式存在。在某一pH环境下，氨基酸主要以两性离子（兼性离子）的形式存在。解离出的阴离子和阳离子数目和趋势相等该溶液pH称为该氨基酸的等电点。酸碱滴定（滴定曲线）氨基酸等电点的确定

甘氨酸的滴定曲线

氨基酸的解离状态是pH的一个函数。R+R0R-24681012140.51.01.52.0OH-加入的当量pHpK1pIpK2（3）（2）（1）Gly的滴定曲线OH-OH-+H3N—C—COOHHH（1）+H3N—C—COO-HH（2）H2N—C—COO-HH（3）Gly解离作用氨基酸的甲醛滴定氨基酸不能直接用酸、碱来测定，为什么？直接滴定，则其等当点pH或过高（12-13），或过低（1-2），没有适当的指示剂可被选用。如何滴定？采用甲醛滴定法，加入过量的甲醛，再用标准NaOH滴定，酚酞作为指示剂。甲醛滴定的原理？

甲醛与氨基酸中的-NH2作用形成-NH.CH2OH-N(CH2OH)2等羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对增强了-NH3+的酸性解离，使pk'2减少了2-3个pH单位，NaOH滴定的曲线A向pH低的方向转移，滴定终点也移动pH9附近。

通过氨基酸的滴定曲线，可用下列Henderson—Hasselbalch方程求出各解离基团的解离常数（pK，）：根据pK，可求出氨基酸的等电点，可由其等电点左右两个pK，值的算术平均值求出。中性氨基酸的pI侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2甘氨酸的电离式pK1=2.34pK2=9.60pI=(pK’1+pK’2)/2

甘氨酸的等电点计算pI=（2.34+9.60）/2=5.97同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2

碱性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2酸性和碱性氨基酸的pI赖氨酸电离式碱性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2pI=（8.95+10.53）/2=9.74pI为9.74？小结pH<pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成

-NH3+，向负极移动。pH=pI时，氨基酸净电荷为零。pH>pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。

酸性溶液晶体状态碱性溶液或水溶液中即等电点（pI）pI——

等电点时的pH不同氨基酸等电点（pI）不同提问：为什么？答案：-R有电性区别。中性氨基酸pI一般为6.0提问：为什么偏酸性？答案：

-COOH解离程度略大于-NH2的得电子能力

提问：酸性氨基酸的pI(更偏酸、更偏碱）？答案：更酸（3.0左右）碱性氨基酸pI更碱（7.6—10.7)(

只有三种）提问：大多数氨基酸在中性（pH=7）时，带

电？负提问：等电点时的氨基酸特点是？答案：

两性离子，溶解度最小，容易沉淀。提问：为什么？答案：同性排斥力小，凝结沉淀酸性氨基酸(Glu,Asp)及CysCHCOOHCOOHH3N+CH2CHCOOHCOO-H3N+CH2CHCOO-COO-H3N+CH2CHCOO-COO-H2NCH2R+R0R-R2-pK1pKRpK2碱性氨基酸(Lys,Arg,His)CHH3N+COOHH3N+(CH2)4CHH3N+COO-H3N+(CH2)4CHH3N+COO-H2N(CH2)4CHH2NCOO-H2N(CH2)4R2+R+R0R-pK1pK2pKR（四）氨基酸的重要化学反应

羟甲基化反应亚硝酸盐反应烃基化反应酰化反应脱氨基反应西佛碱反应成盐成酯反应成酰氯反应脱羧基反应叠氮反应侧链反应COOHCHH2NR1、－氨基和－羧基同时参加的反应茚三酮反应(Ninhydrinreaction)弱酸加热

除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。用途：根据570nm颜色强度计算氨基酸和蛋白质浓度。法医学上用于采集犯罪现场的指纹。前情回顾1.测得一蛋白质样品的氮含量为0.4g，此样品约含蛋白质多少?2.组成蛋白质的氨基酸有

种，它们的结构通式为

，结构上彼此不同的部分是

。3.当氨基酸处于等电点时，它以

离子形式存在，这时它的溶解度

，当pH>pI时，氨基酸以

离子形式存在。4.脯氨酸是

氨基酸，与茚三酮反应生成

色产物。5.具有紫外吸收能力的氨基酸有

、

和

。一般最大光吸收在

nm波长处。6.组成蛋白质的氨基酸中，含硫的氨基酸有

和

两种。能形成二硫键的氨基酸是

由于它含有

基团。2.5g20R两性/兼性最小阴亚氨黄苯丙氨酸酪氨酸色氨酸280甲硫氨酸半胱氨酸半胱氨酸巯基2、烃基化反应－桑格反应、艾德曼反应（1）桑格试剂：2,4-二硝基氟苯（DNFB）（R’＝烃基）2，4一二硝基氟苯氨基酸的氨基的一个H被烃基取代芥子气毒性原理2,4-二硝基氟苯反应(DNFBorFDNB)NNH2-Gly—Ala—Ser

C

＋DNFB（碱性条件下）

→DNP-NH-

Gly—Ala—Ser

（黄色）

→酸水解

→

DNP-NH-

Gly

+各种游离的aa

→

纸层析、薄层层析、HPLC

→分析鉴定用途：Sanger试剂，鉴定蛋白质和多肽的N-末端氨基酸残基。（2）艾德曼反应（Edmanreaction）--苯异硫氰酸（PITC）aa＋PITC（弱碱下）→

PTC-aa（黄色）

→酸和硝基甲烷中环化

→

PTH-aa

→

层析

→分析鉴定用途：Edman反应，

蛋白质或多肽氨基酸序列测定。苯异硫氰酸酯，PITC

苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。据此原理设计出来的氨基酸自动序列仪（aminoacidsequenator）市场上已有出售，在对几种蛋白质一级结构的确定上发挥了威力。

三氨基酸的分离分析

分配柱层析：支持剂－具亲水性的不溶性物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。滤纸层析：薄层层析：离子交换层析：阴离子交换树脂-N(CH3)3OH，阳离子交换树脂-SO3H电泳：（一）电泳

是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下，向带相反电荷的电极做定向移动的现象。

分离氨基酸混合物常用纸电泳。（二）分配层析

一种溶质在两种互不相溶或几乎不相溶的溶剂中分配时,在一定温度下平衡后,溶质在两相溶剂中的浓度比值与其溶解度比值相等,此比值称分配系数如在酚-水系统分配时,每种aa有特定分配系数,依此可用逆流分配法分离.固定相：借助一定支持物（如：纤维素、淀粉、硅胶等亲水性不溶物质），以结合水为固定相。流动相：以与水不溶的有机溶剂（如：酚、正丁醇）为流动相。方法：流动相流过支持物，将分配系数不同的氨基酸分开，以茚三酮显色，形成色谱，扫描定量，或洗脱后比色定量。分配柱层析纸层析（2）离子交换层析原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。带酸性基团、能解离出质子，与溶液中阳离子发生交换的叫阳离子交换树脂。-SO3H(强酸型)、－COOH(弱酸型)带正电荷的AA与阳离子交换树脂结合力强。带碱性基团、能解离出OH-、可与溶液中阴离子发生交换的叫阴离子交换树脂。－N(CH3)OH(强碱型)、-NH3OH(弱碱型)带负电荷的AA与阴离子交换树脂结合力强。离子交换层析分离氨基酸的原理（3）高效液相层析（HPLC）

highperformanceliquidchromatography

溶剂系统为高压

优点：快速、灵敏、高效固定相支持剂颗粒细，表面积大；采取高压，洗脱速度快。

蛋白质II：蛋白质的结构与功能

蛋白质结构决定其功能第一节肽一、肽的结构及命名由一个氨基酸的-NH2与另一氨基酸的-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。肽链中的酰胺基（-CO-NH-）称为肽基.两分子氨基酸缩合形成二肽(dipeptide)，三分子氨基酸缩合则形成三肽(tripeptide)……十个以内氨基酸相连而成的肽称寡肽(oligopeptide)更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端氨基酸的顺序是N端→C端的排列顺序。如上述五肽可表示为：丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰胺

Ser-Val-Tyr-Asp-GlnS-V-Y-D-QCOOH组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。２.肽键的结构特点：

氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上，这个平面称为肽平面。在大多数情况下，相邻肽平面以反式结构存在。

ＮＣＯ虽是单键却有双键性质周边六个原子在同一平面上前后两个a-C在对角CNCHaNCOCa0.123nm0.132nm0.153nm0.147nmC-N0.149nmC=N0.127nm二、天然活性肽（游离肽）生物体内非蛋白质水解而自然存在的游离肽段脑啡肽、加压素、催产素等生物激素短杆菌肽S、放线菌素D等抗生素蛇毒多肽、鬼笔鹅膏等生物毒素肌肉中的鹅肌肽、肌肽等无法解释功能的肽段1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸/γ-ECGGSH/GSSG还原型/氧化型三肽，含巯基保护含有-SH的蛋白质抗氧化，除自由基整合解毒2、催产素和加压素均为下丘脑分泌，储存在垂体后叶的激素。催产素（缩宫素，oxytocin）使子宫和乳腺平滑肌收缩，具催产和促乳腺排乳作用。加压素（升压素，vasopressin）也称抗利尿激素，调节水代谢。促进血管平滑肌收缩，升高血压，促进水分的重吸收，减少排尿。第二节蛋白质的分子结构

随着蛋白质化学研究的进展，越来越多的人认为在二级结构和三级结构之间应加入超二级结构和结构域这两个层次，所以蛋白质的结构层次为：一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构一、蛋白质的一级结构（primarystructure）

1．含义：一级结构又叫初级结构：即肽链中氨基酸的组成及其排列顺序。其中，氨基酸组成——种类和含量。一级结构是高级结构的化学基础，也是认识蛋白质分子生物学功能、结构与生物进化的关系、结构变异与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括

(1)组成蛋白质的多肽链数目;(2)多肽链的氨基酸顺序;(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。

★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。胰岛素的一级结构：胰岛素是动物胰脏β细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，主要功能是降低体内血糖含量。英国Sanger等人于1953年首先完成了胰岛素的全部化学结构的测定工作。胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。含A、B两条链（A链：21肽；B链：30肽）。A-ChainB-ChainGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnGIVEQCCASVCSLYQLENYCNA链一级结构表示方法：A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之间形成一个链内二硫键。2.蛋白质一级结构测定的意义①是推测蛋白质高级结构的分子依据②是理解蛋白质生理功能的分子基础③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段④是研究生物进化的分子佐证

推断

预测

氨基酸序列（一级结构）

→

空间结构

（高级结构）

→

功能

3.一级结构测定的原则和基本流程一级结构测定的原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定拆开二硫键纯蛋白质蛋白质顺序测定基本战略一级结构的测定主要用小片段重叠的原理通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列

测定蛋白质的一级结构前的准备工作A.样品纯度必须>97%以上；聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带B.测定蛋白质的相对分子质量；

SDS，凝胶过滤法，沉降系数法C.测定蛋白质多肽链种类和数目(亚基个数)；

SDS，N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数；E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。蛋白质一级结构测定的基本流程:（1）测定蛋白质分子中多肽链数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。（2）拆分蛋白质分子的多肽链

①拆分非共价键：可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理。②拆分二硫键：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。拆分（2）拆分蛋白质分子的多肽链（3）分析多肽链氨基酸组成（4）鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基两类多肽链末端氨基酸残基：

N-端氨基酸（二硝基苯氟Sanger法；苯异硫氰酸酯--PITC法；丹磺酰氯--DNS法）

C-端氨基酸（肼解法；还原法；羧肽酶法）在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析方法①二硝基氟苯--Sanger法反应特点:A.为α-NH2的反应

B.氨基酸α-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸N末端分析方法②苯异硫氰酸--PITC法苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）由于其连续反应特性，成为蛋白质序列分析仪的分析原理！C末端分析方法①肼解法Gln，Asn，Cys被破坏不易测出，C-末端Arg转变为鸟氨酸②羧肽酶法（主要）C末端分析方法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。常用的羧肽酶四种：A,B,C和Y。A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母)羧肽酶A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基羧肽酶B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键（5）用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小的片段酶解法:胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等。化学法：可获得较大的肽段。溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。A1A2A3A4B1B2B3（6）测定各肽段的氨基酸序列方法：蛋白质序列分析仪原理：1.Edman法；2.DNS-Edman法；3.有色-Edman法（7）重建完整多肽链的一级结构对角线电泳动态图解ab（8）确定半胱氨酸残基间形成二硫键的位置对角线电泳一种特殊的双向电泳4、蛋白质序列数据库蛋白质信息库(ProteinInformationResource,PIR)－美国国家生物医学基金会主持基因序列库GenBank－美国国家支持欧洲分子生物学实验室数据库EMBL(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)－欧盟国家多数序列从基因反义而来，少数经AA测定得到。蛋白质三维结构二级结构三级结构四级结构超二级结构和结构域蛋白质的三维结构

二、蛋白质二级结构

蛋白质的二级结构（secondarystructure）蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架盘绕折叠，依靠氢键维持固定所形成的有规律性的结构。它并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键：

氢键(一)蛋白质二级结构类型

1.

α－螺旋（α－helix）2.β－折叠（β-pleatedsheet）3.β－转角（β-turn）4.无规则卷曲（nonregularcoil）1、－螺旋（－helix）是由Pauling和Corey等于1951年研究羊毛、马鬃等角蛋白时提出的结构模型，指多肽链主链骨架围绕螺旋的中心轴一圈一圈地上升而形成螺旋式构象，类似螺旋式楼梯那样，螺旋构象依靠氢键来维持。-螺旋结构特征为：①螺旋的方向为右手螺旋，每3.6个氨基酸旋转一周，螺距为0.54nm,每个氨基酸残基的高度为0.15nm。②相邻螺圈之间形成链内氢键，即每个残基上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键。氢键的取向几乎与中心轴平行。③R基侧链分布在螺旋的外侧。其形状、大小及电荷等均影响α螺旋的形成和稳定性。

-螺旋结构的稳定主要靠链内氢键维持RRRRRRRRR螺旋的横截面

蛋白质中的α-螺旋几乎都是右手螺旋，左手螺旋只是在极少数的蛋白质中发现，如嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手螺旋。右手螺旋比左手螺旋稳定。影响α-螺旋稳定性的因素

在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，α-螺旋就不稳定。

在多肽链中只要出现Pro，α-螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节（kink）。

Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。

肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋。

2、－折叠（－pleatedsheet）

也是Pauling等人提出来的，它是与α-螺旋完全不同的一种结构。

β-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。①在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm

。0.7nm

②-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。（a）平行式（b）反平行式③-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。后者更为稳定。反平行的重复周期（肽链同侧两个相邻的同一基团之间的距离）为0.7nm，平行的为0.65nm。

－折叠片主要特点：（1）所有肽键都参与链间氢键的交联，氢键与肽链的长轴接近垂直；（2）多肽主链取锯齿状折叠构象；（3）侧链交替分布在片层平面的两侧；（4）－折叠片有平行式，反平行式。-折叠存在于球状及纤维状蛋白质（-角蛋白）中。是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质丝心蛋白为片层结构，即反平行式β-折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系（丝柔软）。分子中不含-螺旋（不能拉伸）。-角蛋白－丝心蛋白(fibroin)3、－转角（－turn）在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子的表面。-转角处的氨基酸多为脯氨酸和甘氨酸。-转角是多肽链180°回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为：⑴主链骨架本身以大约180°回折;⑵回折部分通常由四个氨基酸残基构成;⑶构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。

中央肽基旋转180º4、无规卷曲(randomcoil)无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。对于特定的蛋白质分子而言，其无规卷曲部分的构象则是特异的。α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲核糖核酸酶分子中的二级结构课前复习1.蛋白质的一级结构是指

。2.α-螺旋结构是由同一肽链的

和

间的

键维持的。若一个α-螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有___圈螺旋，该α-螺旋片段的轴长为_____。天然蛋白质分子中的α-螺旋大都属于___手螺旋。3.β-转角通常涉及___个氨基酸，β-转角处的氨基酸通常为______和_______。（09年中南民族大学）4.两条相当伸展的肽链（或同一条肽链的两个伸展的片段）之间形成氢键的结构单元称为

___。蛋白质中氨基酸的排列顺序C=ON-H氢5027nm右4甘氨酸脯氨酸β-折叠三、超二级结构和结构域（domain)1、超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：αα；βαβ；βββ．ααββββαβ是由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。存在于α-角蛋白、肌球蛋白、纤维蛋白原中。①αα毛发-角蛋白三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维的超二级结构，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维(8nm)，成百根微纤维结合成大纤微(200nm)，构成毛发的结构元件。α-螺旋之间有二硫键交联以维持其稳定性-角蛋白的伸缩性能很好，在湿热条件（破坏氢键）下可以伸展转变成-折叠结构（称为-角蛋白）。烫发时氧化剂卷发(烫发)的生物化学基础②βαββαβ两段平形式β折叠股和一段作为连接的α-螺旋组成。

三条或更多条反平行式β-链通过β-转角连接而成。T4溶菌酶、葡萄球菌核酸酶、乳酸脱氢酶活性部位都含有此结构。③ββββββ回形拓扑结构β-迂回在较大的球状蛋白质分子中,一条多肽链往往在二级结构或超二级结构的基础上折叠形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域。每个结构域是独立折叠的，然后彼此靠拢，形成球状蛋白。对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由100~200个氨基酸残基组成。2、结构域（structuraldomain）木瓜蛋白酶结构域之间只有一条柔性的肽链连接（铰链区），使结构域容易发生相对运动，故常是酶的活性中心或别构中心部位。木瓜蛋白酶

结构域有时也称功能域，功能域是指有功能的部分。功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。

从动力学的角度耒看，一条长的多肽链先折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构更合理。

从功能的角度耒看，酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间，因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链，使结构域在空间上摆动比较自由，容易形成适合底物结合的空间。四、蛋白质的三级结构(tertiarystructure）（一）定义是指多肽链在二级结构、超二级结构以及结构域的基础上，进一步卷曲折叠形成复杂的球状分子结构。

包括多肽链中一切原子的空间排列方式。肌红蛋白许多在一级结构上相差很远的AA残基在三级结构上相距很近。肌红蛋白肌红蛋白是哺乳动物肌肉中的储氧蛋白质。海洋哺乳动物的肌肉中含大量肌红蛋白，因而可长时间潜水。它由一条多肽链构成，包含153个AA残基和一个血红素辅基，分子量为16700道尔顿。HGFEDCBA蛋白质三级结构特征：(1)含有多种二级结构；(2)具有明显的折叠层次；(3)球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴，空穴周围有许多疏水侧链，是疏水区，这空穴往往是酶的活性部位或蛋白质的功能部位。氢键：氧或N原子与H原子之间形成的范德华力：非特异性引力，比离子键弱疏水作用：非极性侧链之间；在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。疏水作用是疏水基团或疏水侧链出于避开水的需要而被迫接近。盐键--离子键：带正电和带负电的侧链之间二硫键:Cys之间尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。维系蛋白质三级结构的作用力

如果破坏了这些作用力，蛋白质的三级结构就被破坏，其生物功能就丧失。五、蛋白质的四级结构是由两条或两条以上具有三级结构的多肽链通过次级键缔合而成的特定构象。其中每条具有三级结构的多肽链称为亚基，亚基一般只包含一条多肽链。但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。亚基也叫单体，由2个或多个亚基组成的蛋白质统称为寡聚蛋白或多体蛋白。无四级结构的蛋白质称为单体蛋白（如肌红蛋白）。蛋白质四级结构的形成能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更加完善。在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水作用。疏水作用是最主要的作用力。

血红蛋白血红蛋白是血液中红细胞的主要成分，具有运输O2的功能，分子量为65000。由4个亚基构成一个四面体结构，每个亚基的三级结构都与肌红蛋白相似，但一级结构相差较大。从一级结构到四级结构血红蛋白蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节一、蛋白质的一级结构与功能的关系蛋白质一级结构的差异与生物进化蛋白质一级结构的变异与分子病蛋白质一级结构的局部断裂与蛋白质的激活（1）蛋白质一级结构的差异与生物进化

同源蛋白质是指在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质，如真核生物线粒体中的细胞色素c。细胞色素c是线粒体内膜的一种含铁的蛋白质，在真核细胞的生物氧化过程中起传递电子的作用。大多数种属的细胞色素c，分子量约为12500，含有100个左右的AA残基。14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基

不变的AA残基35个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。根据同源蛋白质的氨基酸顺序资料可以绘制进化树（说明物种之间进化关系的图解）。与根据经典分类学建立的系统树一致。（2）蛋白质一级结构的变异与分子病分子病：由于基因突变导致某蛋白质一级结构发生变异，从而使该蛋白质生物学功能部分或全部丧失而引起的疾病。

镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病。这种病人的红细胞在氧不足时变形而成镰刀状，故名。由于红血球不正常带来严重后果。

（遗传密码由CTT→CAT）生理条件下Glu-亲水，Val-疏水，故当Glu被Val取代后，显著降低了血红蛋白的溶解度，使患者的血红蛋白分子容易聚集成纤维状血红蛋白，导致红细胞收缩变形成镰刀状。说明一个关键氨基酸的突变有可能导致蛋白质功能的失常。（3）蛋白质一级结构的局部断裂与蛋白质的激活

在生物体的某些生物化学过程中，蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂才能呈现生物活性。（切除冗余及其它变化）前体蛋白（一级结构冗余，高级结构错误，因此无生物活性）活性蛋白（具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）适合环境【经典举例】84个氨基酸的胰岛素原（proinsulin），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。如图所示:猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图二、蛋白质的高级结构与功能的关系NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanol变性复性8mol/L尿素

β-巯基乙醇Dialysis透析除去尿素和巯基乙醇1、核糖核酸酶变性与复性未知蛋白2、蛋白质的变构现象（1）海绵状脑病是由阮病毒蛋白（prionprotein,PrP）构象改变导致蛋白质聚集，形成蛋白水解酶的淀粉样沉淀，从而引起人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α螺旋，对蛋白酶敏感，水溶性，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白的作用下可转变成为β折叠，抗蛋白酶，水溶性差，蛋白聚集成淀粉样沉淀，从而致病。PrPscβ-折叠海绵状脑病PrPc

α螺旋正常

一些蛋白质由于受某些因素的影响，其一级结构不变而空间结构发生变化，导致其生物功能的改变，称蛋白质的变构现象或别构现象。（2）血红蛋白（Hb）氧结合引起的血红蛋白构象变化

总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。III：蛋白质的性质、分离与鉴定第一节蛋白质的重要性质（一）蛋白质的两性性质及等电点（二）蛋白质的紫外吸收（三）蛋白质的胶体性质（四）蛋白质的沉淀（五）蛋白质的变性与复性（六）蛋白质的呈色反应（一）蛋白质的两性性质与等电点蛋白质多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。在生理条件下，这些基团解离使蛋白质即可作为酸又可作为碱，所以蛋白质也是两性电解质。对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。在电场中，若蛋白质分子所带净电荷为正，则向负极移动；反之，净电荷为负，向正极移动。这种泳动现象称为电泳。在电场中，不同的蛋白质因大小、形状、带电量不同，泳动速度不同，因此可用电泳的方法分离、纯化蛋白质。电泳electrophoresis（二）蛋白质的紫外吸收

蛋白质中的Tyr、Trp、Phe残基在近紫外光区有光吸收，致使蛋白质在280nm有最大特征的光吸收。在一定范围内，蛋白质溶液在280nm波长的光吸收值A280与其浓度成正比，可用比色法测定蛋白质含量。（三）蛋白质的胶体性质

蛋白质是高分子化合物，它在水溶液中形成的单分子颗粒的直径在1-100nm之间，属于胶体溶液的颗粒大小范围，因此蛋白质水溶液是胶体溶液，具有胶体溶液的特征，如布朗运动、丁道尔现象、不能透过半透膜等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用透析法使蛋白质与其它小分子物质如无机盐、单糖分开。透析（dialysis)是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。超滤

超滤：是利用外加压或离心使水和其他成分通过半透膜，蛋白质留在膜上。

浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过。梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法。脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。超滤的主要应用：

蛋白质水溶液是一种稳定的胶体溶液，分子之间不易聚集成大颗粒而沉淀。原因：①蛋白质分子大小达到胶体质点范围，具较大表面积。②蛋白质分子表面分布着许多极性基团，如-N+H3,-COO-,-OH,-SH等，极易吸附水分子，使蛋白质分子颗粒外围形成一层水膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚沉淀。蛋白质水溶液是一种稳定的胶体溶液--③蛋白质是两性电解质，在非等电点状态时，相同的蛋白质颗粒带有同性电荷，使蛋白质颗粒之间互相排斥，保持一定的距离，不至互相聚集沉淀。蛋白质溶液的pH在等电点时溶解度最小。--维系蛋白质三级结构的作用力？非共价键或次级键包括氢键、范德华力、疏水相互作用和离子键（盐键）共价键—二硫键举例说明蛋白质的结构与其功能之间的关系？1、蛋白质的一级结构与功能的关系①蛋白质一级结构的差异与生物进化②蛋白质一级结构的变异与分子病③蛋白质一级结构的局部断裂与蛋白质的激活2、蛋白质的高级结构与功能的关系蛋白质有特定的构象，这种构象与它们各自的功能相适应。蛋白质的空间结构遭到破坏时，生物学功能也随之丧失。①核糖核酸酶的变性与复性②蛋白质的变构：阮病毒蛋白；血红蛋白（四）蛋白质的沉淀在蛋白质溶液中加入适当化学试剂，破坏蛋白质表面的水化膜或中和蛋白质的电荷，使蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。2.沉淀种类：可逆与不可逆蛋白质的沉淀作用3.沉淀方法：

盐析法

有机溶剂沉淀法

重金属盐沉淀法

生物碱试剂和某些酸类沉淀法

加热变性沉淀法

引起蛋白质沉淀的因素：1、高浓度的中性盐类

在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。

盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。

原因

不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：卵清蛋白球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%饱和度饱和析出析出

分段盐析(NH4)2SO4

盐溶而低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。盐溶作用是由于在盐浓度较低时，盐离子被蛋白质分子吸附，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强了，因而溶解度增加。2、有机溶剂

与水互溶的极性有机溶剂（乙醇、丙酮）能使蛋白质从水溶液中沉淀出来。有机溶剂引起蛋白质沉淀的原因是：

①降低溶液的介电常数（因为有机溶剂是低介电常数物质）。介电常数降低将增加两个相反电荷之间的吸引力（库仑定律），这样蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，从而使蛋白质分子聚集沉淀。

不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。②有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子聚集沉淀。有机溶剂来沉底分离蛋白质时，需在低温下进行，在较高温度下进行会破坏蛋白质的天然构象。盐析和有机溶剂制得蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。3、重金属盐

蛋白质在碱性溶液中（pH>pI)解离成阴离子而带负电荷，可与带正电荷的重金属离子如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等结合成不溶性蛋白盐而沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。4、生物碱试剂和某些酸类沉淀法

生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。

“柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。5、热变性沉淀

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2)的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。（五）蛋白质的变性1、蛋白质变性的概念：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，空间构象发生变化，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。2、使蛋白质变性的因素a.物理因素：高温、高压、射线等

b.化学因素：强酸、强碱、重金属盐等3、变性的本质：分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。蛋白质的变性变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也没有原来蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。2、蛋白质变性后的特征①生物活性丧失。蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体等活性，以及其他特殊性质如血红蛋白的载氧能力等。生物活性的丧失是蛋白质变性的主要特征。②理化性质改变。蛋白质变性后，疏水基外露，溶解性降低，一般在等电点区域凝聚沉淀；球状蛋白变性后，分子形状也发生改变，分子伸展，不对称性增加，表现为粘度增加，扩散系数降低；③生物化学性质改变。蛋白质变性后，分子结构伸展松散，比天然蛋白质易为蛋白水解酶分解。制备活性蛋白质时严防蛋白质变性！蛋白质变性的可逆性－复性：某些蛋白质变性后可以在一定的条件下重新形成原来的空间结构，并恢复原来部分理化特性和生物学活性，这个过程称为蛋白质的复性（renaturation）。蛋白质变性的可逆性与复性

蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下不能复性；如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或蛋白质具有特殊的分子结构,并经特殊处理则可以复性。蛋白质的热变性与凝固作用蛋白质的凝固作用天然蛋白质变性后，变性蛋白质分子互相凝集或相互穿插缠绕在一起的现象成为蛋白质的凝固（coagulation）。凝固作用分两个阶段：首先是变性；其次失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮;蛋白质变性的应用

理论上：研究蛋白质分子结构与功能,分子量测定,亚单位拆分；

生产生活中有利的一面：食品加工，消毒灭菌等；非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；

生产生活中不利的一面：活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；（六）蛋白质的颜色反应1、双缩脲反应

两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样反应肽键的反应，肽键越多颜色越深，粉红，紫红，蓝紫受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度2、福林酚试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸与双缩脲法结合Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍3、茚三酮反应多肽与蛋白质都能与之反应生成紫红色化合物。灵敏度差。第二节蛋白质的分离纯化及分子量测定（一）分离纯化的一般原则（二）分离纯化的方法（三）蛋白质分子量的测定①研究其结构与功能②工农业生产的需要③医疗业的需要④研究需要（一）分离纯化的一般原则

电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析1、材料的预处理及细胞破碎（二）分离纯化的方法细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机

细胞的破碎

机械法匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一组织捣碎：注意维持低温环境研磨：破碎单一细胞的有效方法，主要用于细菌、酵母等的破碎

物理法

超声法：输入高能超声波可以破碎细胞，破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等

在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用

注意:超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大

反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质

冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质

低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解

化学法

有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来

表面活性剂(surfactant)：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等

酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶（1）根据分子大小不同的纯化方法

a、透析和超过滤2、蛋白质粗制品的获得b、密度梯度离心：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。◆为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这种溶质称为梯度介质。常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度5～60%，密度范围1.02～1.30g/cm2。c、凝胶层析凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。

基本原理当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，（分子筛效应）从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。（2）利用溶解度差别的纯化方法①等电点沉淀法调整溶液pH

不同蛋白在各自pI处依次沉淀③有机溶剂沉淀法降低介电常数争夺水化膜②盐析和盐溶法①等电点沉淀法蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的pH被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH的蛋白质仍然留在溶液中。②盐析和盐溶法蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀.常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离.盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层，使蛋白质溶解度增加；盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。（3）有机溶剂沉淀法蛋白质溶液中，加一定量与水互溶的有机溶剂，这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为防止蛋白质分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，且需要在低温条件下进行。（3）利用蛋白质电荷不同的纯化方法

A、电泳：原理与AA的电泳相同带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密