饲料中粗蛋白质的测定

水产动物

营养与饲料饲料中粗蛋白质的测定

（凯氏定氮法）一、适用范围

配合饲料浓缩饲料单一饲料

二、原理饲料在催化剂的作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵，加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，在用盐酸滴定，测出含氮量。饲料中粗蛋白质含量（CP）=含N量×6.25三、试剂硫酸钾或硫酸钠五水硫酸酮混合催化剂：五水硫酸酮：硫酸钾或硫酸钠=1：15（W/W）研碎混均混合指示剂甲基红0.1%乙醇容液、溴甲酚绿0.5%乙醇容液，两溶液等体积混合盐酸标准溶液C(HCI)=0.0213moL/L硼酸2%硼酸溶液：2克硼酸溶解在100ml水中(W/V)，需加热溶解。加入混合指示剂0.25%（V/V），摇均，硼酸溶液呈淡紫红色。2%硼酸溶液

NaOH40%NaOH溶液注意安全！蒸馏水四、主要仪器设备（一）分析天平：感量0.0001g（二）消煮炉消煮炉：变阻电炉，可调整温度。调温旋纽（三）酸式滴定管滴定管：酸式;25ml;读数:0.00(小数两位)。（四）锥形瓶：150ml（2个）锥形瓶：150ml（2个）（五）容量瓶：100ml(2个)容量瓶：100ml(2个)（六）凯氏烧瓶凯氏烧瓶：100ml(2个)（七）移液管、刻度吸管移液管：10ml、刻度吸管：10ml（八）量杯量杯：10ml（量取NaOH溶液）20ml（量取硼酸溶液）（九）消煮架消煮架（十）通风橱内装排气扇，排除有毒气体内装排气扇（十一）半微量凯氏蒸馏装置（十二）称样纸长纸条：方纸快：（十三）药勺、洗瓶药勺：用于固体试剂及饲料样品的取出洗瓶：盛蒸馏水五、试样的选取与制备选取试样：按照饲料样本的采集原则选取试样试样的制备：“四分法”缩至200克粉碎：全部通过0.44mm筛（40目）装瓶：装入样品瓶，贴上标签备用（一）样品的称量天平的准备：接通电源，预热20分钟称取样纸的重量并记录：六、步骤

样品鱼粉称样称样：称取样品0.2-0.5g(四位小数)无损的放入凯氏烧瓶中方法：⑴将盛有样品的长纸条放入粗天平上约重。⑵再将盛有样品的长纸条放入电子天平上称重.⑶凯氏烧瓶横置

小心将盛有样品的长纸条放入凯氏烧瓶中，凯氏烧瓶竖立，样品倒入凯氏烧瓶底部。勿使样品倒入瓶颈部！⑷再将凯氏烧瓶横置，水平移出长纸条，放入天平回称纸重。防止样纸粘着的样品洒落！记录：

⑴称样纸+样品重（m1）

1号：0.8835g2号：0.9112g（取四位小数）⑵回称纸重（m2）

1号：0.5833g2号：0.5842g（取四位小数）

⑶计算试样质量（m）

m=m1—m21号：0.3002g2号：

0.3270g（取四位小数）操作步骤（三）加入混合催化剂称样纸约重（粗天平）粗天平称取混合催化剂6.4g混合催化剂放入凯氏烧瓶中：凯氏烧瓶横置小心将盛有混合催化剂的纸条放入凯氏烧瓶中，凯氏烧瓶竖立，混合催化剂倒入凯氏烧瓶底部。（四）加入硫酸准备10ml刻度吸管，洗涤干净备用。移取10ml硫酸放入凯氏烧瓶中：将刻度吸管放入凯氏烧瓶颈上部，微微松开食指缓缓放出硫酸，并不断转动烧瓶。注意：凯氏烧瓶口与硫酸瓶口靠近，食指紧按刻度吸管管口，勿使硫酸外滴到他处。（五）消煮将凯氏烧瓶放入通风橱内的消煮架上，倾斜60度左右。打开排风扇排出有害气体及酸雾。电炉加热：开始小火，待样品焦化泡沫消失，再加强火力(酸雾在颈部2/3处泠凝)直至呈透明的蓝绿色，再继续加热2h。消煮过程中要不断转动凯氏烧瓶，以使焦化的样品浸入硫酸溶液加速消煮过程。

消煮过程溶液颜色的变化：黑色→深褐色→浅褐色→黄色→黄绿色→蓝绿色→蓝色（六）试样消煮液的转移与定容试样消煮液的转移：◆100ml容量瓶洗涤干净（并编号与凯氏烧瓶一致）、漏斗洗涤干净备用。◆试样消煮液冷却至室温，用洗瓶加入约20ml蒸馏水，旋摇，冷却至室温，借助漏斗转移倒容量瓶中，多次反复用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶与漏斗，洗液全部入容量瓶。注意：每次尽量倒入漏斗中央，少沾内壁。最后凯氏烧瓶紧靠漏斗内壁，以免最后一滴顺着凯氏烧瓶的外壁流出。使结果偏低。用蒸馏水稀释到容量瓶容积的2/3时，将容量瓶直立旋摇，稀释至标线时，等候1~2分钟，控制洗瓶逐滴加水至刻度处，摇均备用。试样消煮液的定容操作步骤容量瓶容积2/3时,直立旋摇（七）蒸馏装置的洗涤蒸汽发生器加入三分之二蒸馏水，同时加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，加热，在蒸馏过程中注意此溶液为橙红色，否则补加硫酸接通电源，将蒸汽发生器蒸馏中的水煮沸（提问），连接冷却水（下进上出）。蒸馏装置的洗涤

向反应内室中加入适量蒸馏水，通入蒸汽，煮沸3-5分钟，冲洗。蒸馏装置的洗涤废液排出夹住进气管，使液体虹吸到外室，打开废液管，排出废液。一般洗涤3次。

操作步骤进蒸气管排废液管（八）蒸馏仪器准备锥形瓶：150毫升（装硼酸溶液）洗净烘干移液管：10毫升（移取试样分解液）量杯：10毫升（量取氢氧化钠溶液）20毫升（量取硼酸溶液）将以上仪器洗涤干净备用操作步骤1.蒸馏装置的准备操作步骤蒸发器中的液体沸腾；夹住进气管防止蒸汽进入反应式；打开废液排除管和冷凝管末端并进入大气。2.量取20毫升硼酸溶液:（20毫升量杯量取）于锥形瓶中，放在冷凝管下端，使末端浸入硼酸溶液中。用移液管（漂洗3次）准确移取10毫升试样液，从玻璃杯入口处放入反应内室中，用少量蒸馏水（10ml左右）冲洗入口，洗液入反应室，塞好玻璃塞。蒸馏3.移取试样分解液：加试样液：准确移取10毫升试样液，从玻璃杯入口处放入反应内室，用少量蒸馏水（10ml左右）冲洗入口蒸馏用量杯量取１０毫升氢氧化钠溶液，加至入口处，小心提起玻璃塞，使之快速流入反应室，迅速塞好玻璃塞，在入口处加水密封。

蒸馏4.加碱5.在入口处加水冲洗并密封：

总液体不超过反应室1/3蒸馏水密封！打开进气管，进入蒸汽加热，然后夹住排废液管。蒸汽进入反应室使液体沸腾。（注意：不超过反应室）6.打开进气管蒸馏7.夹住排废液管蒸馏硼酸溶液吸收氨液由红色变为蓝色，计时，蒸馏四分钟，降低锥形瓶，使冷凝管末端离开硼酸液面，再蒸馏１分钟，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液流入锥形瓶，蒸馏结束。排除废液并冲洗。8.蒸馏过程：蒸馏硼酸变蓝反应室液体沸腾。（注意：不超过反应室）

硼酸溶液吸收氨液由红色变为蓝色蒸馏反应室液体沸腾降低锥形瓶，使冷凝管末端离开硼酸液面，再蒸馏１分钟，蒸馏水冲洗冷凝管末端。蒸馏操作步骤操作步骤离开液面冲洗（九）滴定酸式滴定管的准备检查与试漏涂油洗涤用盐酸标准溶液润洗装入盐酸溶液排气泡1.酸式滴定管的准备滴定HCI标准溶液记录初读数（两位小数）1号

0.05ml2号

0.20ml（两位小数）用标准盐酸溶液滴定锥形瓶里的硼酸溶液，边滴边摇，由蓝色变为灰红色为滴定终点。记录终读数（两位小数）1号

10.20ml2号

11.35ml（两位小数）滴定滴定2.滴定过程3.滴定终点：灰红色滴定过量：红色灰红色滴定滴定过量！计算盐酸标准溶液用量：V2=初读数-终读数1号：V1-2=10.20-0.05=10.15(ml)2号：V2-2=11.35-0.20=11.15(ml)滴定4.计算盐酸标准溶液用量：七、空白测定称取0.5克蔗糖代替样品，其余步骤同样品测定。滴定：空白滴定消耗的0.20mol/L盐酸标准溶液的体积V1=0.25（两位小数）

八、结果计算计算：粗蛋白=(V2-V1)×c×0.014×6.25/m×V/Vˊ×100%V2-滴定试样时消耗盐酸标准溶液体积，mlV1-滴定空白时消耗盐酸标准溶液体积，mlC-盐酸标准溶液浓度，mol/Lc=0.0213M-试样质量，gV-试样分解液总体积，mlVˊ-试样分解液蒸馏用体积0.0140：每毫升lmol/L盐酸标准溶液相当于0.0140g的氮6.25：氮换算成蛋白质的平均系数重复性：试样取两个平行样其算术平均值为结果。试样粗蛋白含量在25%以上，允许相对偏差为1%试样粗蛋白含量在10-25%之间，允许相对偏差为2%试样粗蛋白含量在10%以下时，允许相对偏差为3%相对偏差=│测定值-平均值│/平均值蛋白质测定记录表样品名称鱼粉样品号12凯氏烧瓶号12称样纸+样品重（m1克）0.88350.9112回称样纸重（m2克）0.58230.5842样品重（m，克）0.30020.3270测样品时HCI溶液的用量（V2，ml