基因工程的基本操作程序（第三课时）【核心知识精研精讲】 高二生物 （人教版2019选择性必修3）

03第三步：将目的基因导入受体细胞三第三步：将目的基因导入受体细胞受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法我国科学家独创常用显微注射法Ca2+处理法三第三步：将目的基因导入受体细胞植物细胞花粉管通道法方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中含目的基因的DNA溶液（我国科学家独创）（我国科学家独创）三第三步：将目的基因导入受体细胞植物细胞花粉管通道法方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。三第三步：将目的基因导入受体细胞植物细胞花粉管通道法农杆菌转化法转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。农杆菌农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。三第三步：将目的基因导入受体细胞植物细胞花粉管通道法农杆菌转化法转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。农杆菌农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。Ti质粒T-DNA（可转移的DNA）三第三步：将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法农杆菌Ti质粒T-DNA（可转移的DNA）目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌三第三步：将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法农杆菌Ti质粒T-DNA（可转移的DNA）目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞将目的基因插入染色体DNA中三第三步：将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法农杆菌Ti质粒T-DNA（可转移的DNA）目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞将目的基因插入染色体DNA中表现出新性状的植株三第三步：将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法农杆菌Ti质粒T-DNA（可转移的DNA）目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞将目的基因插入染色体DNA中第一次拼接第二次拼接第一次导入第二次导入该过程涉及两次拼接和两次导入，你能总结吗？两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。

三第三步：将目的基因导入受体细胞根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。方法一：可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。受体细胞为受精卵受体细胞为体细胞（利用植物细胞的全能性）目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达农杆菌转化法小结三第三步：将目的基因导入受体细胞三第三步：将目的基因导入受体细胞受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法我国科学家独创常用显微注射法Ca2+处理法三第三步：将目的基因导入受体细胞受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法我国科学家独创常用显微注射法Ca2+处理法三第三步：将目的基因导入受体细胞动物细胞显微注射法将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。三第三步：将目的基因导入受体细胞动物细胞显微注射法将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。受精卵注射器固定吸管显微注射仪构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。三第三步：将目的基因导入受体细胞受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法我国科学家独创常用显微注射法Ca2+处理法三第三步：将目的基因导入受体细胞受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法我国科学家独创常用显微注射法Ca2+处理法三第三步：将目的基因导入受体细胞微生物细胞Ca2+处理法在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。Ca2+感受态细胞吸收三第三步：将目的基因导入受体细胞种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法；花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子04第四步：目的基因的检测与鉴定四第四步：目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质（一）分子水平检测（二）个体生物学水平鉴定方法：抗虫或抗病接种实验

PCR等技术——“抗原—抗体杂交技术”之前我们使用过标记基因检测目的基因是否插入，还记得吗？(4)β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加_____________________的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选___________的菌落作为工程菌生产人胰岛素。氨苄青霉素和X-gal白色四第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因插入位点(4)β-半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将大肠杆菌与基因表达载体混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加_____________________的培养基上培养，待长出菌落后，应挑选___________的菌落作为工程菌生产人胰岛素。氨苄青霉素和X-gal白色四第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因插入位点导入重组质粒导入原质粒导入目的基因未导入成功在加入氨苄青霉素和X-gal的培养基中白色活菌蓝色活菌死亡死亡白色四第四步：目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质（一）分子水平检测（二）个体生物学水平鉴定方法：抗虫或抗病接种实验

PCR等技术——“抗原—抗体杂交技术”PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因！四第四步：目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质（一）分子水平检测（二）个体生物学水平鉴定方法：抗虫或抗病接种实验

PCR等技术——“抗原—抗体杂交技术”PCR和核酸分子杂交技术可更加精准地鉴定受体细胞中是否转入了目的基因！方法1：PCR扩增转基因生物提取DNA根据目的基因的序列设计PCR引物PCR操作是否扩增出目的基因电泳DNA测序技术你知道PCR会扩增出哪些不同的片段吗？什么是电泳？目的基因在整个DNA片段的中央位置复制3次后只含目的基因片段目的基因在整个DNA片段的中央位置复制3次后只含目的基因片段目的基因在整个DNA片段的中央位置复制3次后这两个DNA分子量相同吗？种类1种类2种类3种类4种类5目的基因不在整个DNA片段的中央位置复制3次后只含目的基因片段目的基因不在整个DNA片段的中央位置复制3次后种类1种类2种类3种类4种类5怎么知道里面有该DNA片段？电泳！电泳：在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。正极负极电场力电泳：在电场的作用下，DNA、RNA、蛋白质等这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。正极负极电场力电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。正极负极电场力电泳常用缓冲液pH8.0～8.3DNA分子在此pH条件下带负电荷若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。正极负极电场力电泳常用缓冲液pH8.0～8.3DNA分子在此pH条件下带负电荷若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。正极负极电场力电泳常用缓冲液pH8.0～8.3DNA分子在此pH条件下带负电荷若此时电场里没有任何障碍物，所有DNA片段会以同样的速度向正极移动，怎么让它们移动速度不相同呢？琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。加样孔（加入待测DNA样本）电泳：正极负极电场力琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。片段短，迁移速率快片段长，迁移速率慢在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关凝胶的浓度越大，迁移速率越慢DNA分子越大，迁移速率越慢DNA分子构像有环状、链状等怎么知道这些DNA片段的大小呢？四第四步：目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质（一）分子水平检测（二）个体生物学水平鉴定方法：抗虫或抗病接种实验

PCR等技术——“抗原—抗体杂交技术”方法1：PCR扩增转基因生物提取DNA根据目的基因的序列设计PCR引物PCR操作是否扩增出目的基因电泳DNA测序技术M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果四第四步：目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质（一）分子水平检测（二）个体生物学水平鉴定方法：抗虫或抗病接种实验

PCR等技术——“抗原—抗体杂交技术”方法2：DNA分子杂交技术提取DNA样本基因组DNA酶切DNA片段电泳目标片段（事先不知道）转膜硝酸纤维素膜四第四步：目的基因的检测与鉴定基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段基因探针四第四步：目的基因的检测与鉴定基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段洗去未结合的探针四第四步：目的基因的检测与鉴定基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。硝酸纤维素膜含目的基因的DNA片段洗去未结合的探针显影装置出现杂交带四第四步：目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因（一）分子水平检测方法2：DNA分子杂交技术提取DNA样本基因组DNA酶切DNA片段电泳目标片段（事先不知道）转膜硝酸纤维素膜四第四步：目的基因的检测与鉴定②检测目的基因是否转录出了mRNA（一）分子水平检测转基因生物PCR操作是否扩增出目的基因逆转录cDNA提取RNAmRNA作为模板方法1：PCR扩增四第四步：目的基因的检测与鉴定②检测目的基因是否转录出了mRNA（一）分子水平检测转基因生物PCR操作是否扩增出目的基因逆转录cDNA提取RNAmRNA作为模板方法1：PCR扩增RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图提取RNA转基因生物标记的基因探针方法2：分子杂交技术四第四步：目的基因的检测与鉴定③检测目的基因是否翻译出相应蛋白质（一）分子水平检测如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白方法：

抗原—抗体杂交过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）抗原与抗体的特异性结合原理：四第四步：目的基因的检测与鉴定③检测目的基因是否翻译出相应蛋白质（一）分子水平检测如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白方法：

抗原—抗体杂交过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测

（杂交带）抗原与抗体的特异性结合原理：四第四步：目的基因的检测与鉴定（二）个体生物学水平鉴定目的基因是否表现出相应的性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长功能、活性正常提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较四第四步：目的基因的检测与鉴定（二）个体生物学水平鉴定1.目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增人工合成2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞-关键农杆菌转化法(植物)、显微注射法(