单环刺螠（种质）

单环刺螠（种质）范围本标准规定了单环刺螠Urechisunicinctus（vonDrasche，1881）的术语和定义、学名与分类、主要形态与构造特征、繁殖、分子遗传学特性、检测方法和判定规则。本标准适用于XX省单环刺螠的种质鉴定和检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。刚毛bristle由单环刺螠刚毛囊分泌的几丁质物质形成，包括腹刚毛和尾刚毛，腹刚毛位于口部略后方，尾刚毛分布于肛门周围，有辅助运动功能。学名与分类学名单环刺螠Urechisunicinctus（vonDrasche，1881）。分类地位螠虫动物门（Echiurioidea）、螠纲（Echiurida）、无管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urchidae）、刺螠属（Urechis）。主要形态与构造特征外部形态体呈长圆筒状，前部略细，后部钝圆。口、肛门端位。体表遍布等大的皮肤乳突，其中位于腹刚毛附近的乳突呈环状排列，9～11环。身体淡红、紫红或棕红色。吻短，呈匙状。腹刚毛1对，黄褐色，弯向后方。尾刚毛9～13根，呈单环排列，弯向环外。见图1。单环刺螠外部形态内部构造体壁体壁为皮肤肌肉囊。体腔体腔发达，腔内充满红色体腔液。消化道消化道长而迂回，为体长的5～10倍，通过许多悬肠肌附着于体壁。排泄系统肾管2对，位于体腔前端腹面，兼有生殖输出管和排泄的功能，肾管基部近肾孔处各有1个螺旋体。体后端的排泄腔生有肛门囊1对，呈长囊状。繁殖性成熟年龄雌性和雄性个体均在1龄性成熟。生物学最小型70 mm，体重约20 g。生殖细胞生殖腺无特定形态，在繁殖季节由体腔膜产生原始生殖细胞，进而分化产生生殖原细胞，增殖形成精（卵）母细胞团，游离于体腔液中，再经增殖、生长、减数分裂，形成成熟的精、卵细胞，进入肾管。繁殖期肾管内充满成熟的精、卵，透过体壁可见雄性肾管为乳白色、雌性为橘黄色。怀卵量成熟雌性可多次排卵。体重50 g～60 g个体，怀卵量一般为1.5×106粒～3.0×106粒。分子遗传学特性线粒体细胞色素氧化酶亚单位I（COI）基因序列423 bp，1号单倍型序列如下：CGACCAGAACGAATGCCTTTATTTGTATGGGCCGTAGTCATTACAGCAGTACTATTACTT60TTATCCCTCCCAGTTCTAGCAGGGGCAATTACTATACTTCTGACAGACCGAAACCTAAAT120ACCGCATTTTTCGACCCCCAAGGGGGTGGTGACCCTGTGTTATACCAACATCTCTTTTGA180TTTTTTGGTCATCCAGAGGTCTACATTTTAATTCTCCCGGGCTTTGGGGCTATCTCCCAT240ATCGTCACACAACACGCATCCAAAATAGAAAGATTTGGAACACTAGGTATGATCTATGCA300ATACTTGGAATTGGGGTGTTAGGGTTCATTGTATGAGCTCATCACATATTTACCGTAGGG360ATAGATGTAGACACACGGGCATACTTTACTGCAGCTACCATAATTATTGCCGTTCCAACG420GGA423检测方法抽样按照GB/T18654.2规定执行。外部形态在充足自然光线下肉眼观察。内部构造解剖后用肉眼观察。繁殖性成熟年龄养殖单环刺螠可通过查阅养殖记录确定年龄。怀卵量取繁殖期且发育成熟的雌螠，用手术剪剪除雌螠两端，将肾管完整收集，用过滤海水洗净后，剪断肾管，使用洁净的烧杯收集流出的卵子。将获得的卵细胞全部收集于烧杯中，加入过滤海水稀释成1 000 mL的混合液，搅拌均匀，用移液管吸取0.1 mL，光学显微镜下计数，共取3次并计算平均值。分子遗传学特性分析DNA的提取取体壁100 mg剪碎后，DNA提取试剂盒或常规酚-氯仿方法提取总DNA，灭菌双蒸水溶解备用。引物序列DHCY-F：5'-CGACCAGAACGAATGCCTTT-3'；DHCY-R：5'-TCCCGTTGGAACGGCAATAA-3'。反应条件反应程序：94 ℃变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保温。PCR反应液配方参见附录A。片段回收、纯化与序列测定PCR产物经X脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，测序。判定规则符合第5章要求，且COI基因片段测序结果与第7章序列CLUSTAL比对，K2P遗传距离小于4 %，判定为合格。

（资料性附录）

PCR扩增反应液PCR扩增反应液反应物加入量DNA模板50 ng～100 ng10倍扩增缓冲液2.5 μLMgCl2（25 mmol/L）2.