纳米金与人皮肤成纤维细胞的生物信息学分析

纳米金与人皮肤成纤维细胞的生物信息学分析

1应用生物生物学工具进行生物结构分析纳米金具有许多良好的物理和化学性质特征。广泛应用于医学成像、疾病诊断、药物载体、肿瘤治疗、基因诊断和其他生物医学领域。近年来,纳米生物材料的安全性和生物相容性问题越来越得到各界的重视。借助已建立的动物整体实验和细胞实验方法可以对材料的生物相容性做出评价,但不能进一步揭示材料对机体和细胞的作用机理。只有在分子水平上对生物材料的影响进行深入研究,才能揭示材料与机体相互作用的机理。现代分子生物学技术为分子生物相容性评价提供了更为快速灵敏的方法,但传统的方法偏重于研究单个或少数蛋白质的变化,而蛋白质组学技术的发展为在大规模水平上分析细胞内蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与调控规律,从而进一步阐明生物材料生物相容性分子机理奠定了基础。蛋白质组学技术已经应用于基础生物学、疾病标志物的鉴定、药物开发等领域,近年来已经开始应用于生物材料生物相容性研究中,但这些研究仅对获得的差异表达蛋白质进行了简单的分类。只有应用生物信息学工具对获得的大量差异表达蛋白质数据进行分析,才能对其参与的生物学过程及蛋白质之间的相互关系进行研究,从而进一步解释材料与细胞作用的分子机理。常用的生物信息学分析方法包括聚类,基因本体论(geneontology,GO)分析,生物学途径和蛋白质相互作用网络分析等。GO分析是对蛋白质进行功能注释的标准工具,可以通过3种基因本体论分类:生物学过程、分子功能和细胞组分对生物学数据进行分类。通过对差异表达蛋白质的GO分析,不仅可以观察蛋白质涉及的各功能类别,也可以具体研究蛋白质参与的生物学过程,有助于对蛋白质功能的整体理解和深入分析。本研究组前期已经采用基因表达谱芯片技术和生物信息学方法进行了镍离子的细胞毒性分子机理研究,本文的目的是进一步采用蛋白质组学和生物信息学方法进行纳米金与人皮肤成纤维细胞(humandermalfibroblasts-fetal,HDF-f)作用的分子机理研究。2实验2.1纳米金设备采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备粒径为20nm的纳米金溶胶,应用透射电镜对纳米金进行表征。2.2mtt法测体外细胞毒性测试在80%融合的HDF-f中加入浓度为200μmol/L、粒径为20nm的纳米金,分别培养1、4、8h,采用MTT法进行纳米金的细胞毒性测试。实验重复3次。收集正常培养及浓度为200μmol/L,粒径为20nm纳米金处理1、4、8h后的HDF-f,应用流式细胞术研究纳米金对细胞周期和细胞凋亡的影响。2.3-dige实验裂解正常培养以及浓度为200μmol/L,粒径为20nm纳米金处理1、4、8h后的HDF-f,定量后进行2D-DIGE实验,每组样品重复3次。采用one-wayANOVA筛选差异表达蛋白质点并进行质谱鉴定。选择核纤层蛋白和波形蛋白进行Westernblot验证,内参为beta-actin。2.4不同基因本体论go的分析应用GoSurfer软件对差异表达的功能蛋白质进行GO功能分类分析。3结果与讨论3.1纳米金作用细胞毒性检测采用MTT法和流式细胞术检测纳米金对HDF-f的细胞毒性及对细胞周期和细胞凋亡影响的实验结果列于表1中。MTT实验结果表明,纳米金作用细胞1、4、8h后,细胞增殖率与对照组相比没有显著改变,细胞毒性均为0级(表1第2、3列)。通过流式细胞术研究发现,纳米金与细胞作用1、4、8h后,与对照组相比,S期细胞(DNA合成期)比例有所上升,G2/M期细胞(DNA合成后期/分裂期)比例下降(表1第5~6列),在纳米金与细胞作用4h后,G2/M期细胞下降程度最显著,后期凋亡细胞比例也最多(表1第7列)。3.2h后基质分子质量和功能蛋白表达采用one-wayANOVA筛选原则获得HDF-f与纳米金作用1、4、8h后均发生差异表达的蛋白质点40个,质谱鉴定获得功能蛋白质29个。Westernblot验证实验结果显示,核纤层蛋白和波形蛋白在3个时间点的表达趋势与2D-DIGE实验结果一致,说明2D-DIGE和质谱实验结果可信。3.3纳米金作用细胞后细胞的功能变化应用GoSurfer软件对29个差异表达功能蛋白质进行GO分析,发现其涉及了较广泛的生物学功能。其中差异表达蛋白质富集的“生物学过程”主要涉及细胞过程和生理过程;“分子功能”主要涉及结合和催化活性;而“细胞组分”主要涉及细胞和细胞器。图1是以显著性差异值(One-wayANOVA)为纵坐标(One-wayANOVA值越小,显著性差异越明显),差异表达蛋白质涉及的GO第3层次出现频率为横坐标的统计结果。星号所示为在GO第3层次出现频率最高的5个蛋白质:ITCH、ALB、TUBB、HSPD1、ATP5H。ATP5H是一种ATP合酶,通过利用氧化磷酸化时质子穿膜的电化学陡度而催化线粒体ATP合成。ATP5H在3个时间点都发生上调表达,提示纳米金作用后细胞ATP合酶表达量增多,影响细胞能量代谢状态。考虑到在3个时间都发生上调或下调的蛋白质可能在纳米金与细胞相互作用的调控中发挥更重要作用,所以分别对在3个时间点都上调和都下调表达的蛋白质(表2和3)进一步进行了GO分析。由表2可见,CNBP在所有上调蛋白质中差异表达最显著。CNBP的主要功能是和单链DNA或RNA结合,在cap依赖的鸟氨酸脱羧酶mRNA翻译和固醇介导的转录调节中发挥作用。纳米金作用后,CNBP在3个时间点均高表达,说明纳米金可能通过调节CNBP表达而影响RNA转录过程,进而影响细胞的增殖和分化过程。由表3可见,ITCH在所有下调蛋白质中差异表达最显著。ITCH参与蛋白质运输调控,并可能通过参与Notch介导的信号转导而对免疫反应起调控作用。纳米金作用后ITCH在3个时间点都发生下调表达且表达值持续减小,这可能与其参与纳米金作用细胞后引起细胞免疫反应的调控相关。图2和3分别是5个上调表达蛋白质(表2)和9个下调表达蛋白质(表3)涉及的GO“生物学过程”树状图(由于篇幅所限,本文中未列出GO“分子功能”、“细胞组分”分析结果)。图2和3中黑色节点表示显著性水平p<0.01。表4为3个时间点都发生上调和下调表达的蛋白质涉及的生物学过程的比较,其中第3及后续层次主要列举了部分显著性水平p<0.01的功能类别。由图2、3和表4可见,上调蛋白质和下调蛋白质的GO分类不尽相同。上调表达蛋白质主要涉及4个生物学过程分类(图2),其中显著性水平p<0.01的功能类别涉及了生理过程中的“细胞周期”和生物学过程调控中的“细胞周期调控”、“细胞周期负调控”等,所涉及的蛋白质为FH。FH为柠檬酸循环中的酶,而柠檬酸循环是糖、脂肪和蛋白质在体内彻底氧化的共同代谢途径。本文的结果表明纳米金作用细胞后使与能量代谢相关的FH发生了上调表达,从而可能通过影响“细胞周期”、“细胞周期调控”等功能类别影响细胞周期,使处于细胞周期各期的细胞比例发生变化,与表1中的流式细胞仪测试结果相符。而下调表达蛋白质(图3)则涉及了更多的生物学过程分类(8个)。从图2和3中还可以看到,上调和下调表达蛋白质涉及的生物学过程广泛,其中两者的生理过程涉及的功能最多。由于篇幅所限,本文仅对纳米金作用细胞后获得的差异表达蛋白质的GO分析结果进行了介绍,对差异表达蛋白质参与的生物学途径和蛋白质-蛋白质的相互作用的分析将另文发表。4明蛋白质组学技术尽管细胞水平的实验表明纳米金并不引起细胞毒性,但应用蛋白质组学技术,可以获知纳米金作用后细胞在蛋白质水平发生的变化,说明蛋白质组学技术比细胞毒