基于gc-ms技术的大鼠口服或注射鱼腥草挥发油与甲基正胍酮后血液代谢产物对比研究

基于gc-ms技术的大鼠口服或注射鱼腥草挥发油与甲基正胍酮后血液代谢产物对比研究

临床上常用多味中药和复方药。与西药单成分相比,中药复方成分是一个多成分有机整体,与自然界其他生物体一样,中药材体现遗传多态性,其复方成分必然是多样的。由于中药的有效成分是由原药材植物以初生、次生代谢酶系,特别是以CYP450为主导的生物酶系合成的次生代谢产物,进入人体同样受人体CYP450家族酶代谢并与原植物合成酶相似的人体内的初生代谢酶系(受体)作用产生反治互补的效应。根据生物物理学原理,中药与人体同为地球生物圈内的生物个体,其生长发育普遍受到生物代谢规律的制约,生物界存在巨大的代谢网络,其微观成分间可相互代谢而联通,多同母核群生,称之“网通性”,而群成分的整体代谢程度又受到遗传势的控制,体现“虹势性”,因此中药与人体的作用体现“网通虹势”多重遗传谱效动力学,这是地球生物间代谢与作用的普遍遵循的规律,其母核越相似,代谢网越相近,其药效越相近。因此通过对中药“网通虹势”代谢规律的探讨可为中药复方作用的物质基础研究奠定基础,本文为其前期的“网通性”规律研究。鱼腥草是三白草科蕺菜HouttuyniacordataThunb.的宿根性多年生草本植物,具有清热利湿、消肿解毒、化痰止咳的功效。现代研究发现其主要化学成分为挥发油类、黄酮类、有机酸、脂肪酸、氨基酸以及生物碱类成分。其中挥发油类为主要药效成分,其鲜草含挥发油0.049%,主要有鱼腥草素(癸酰乙醛)、癸醛、月桂醛及甲基正壬酮等成分。临床上曾广泛应用的鱼腥草注射液是从鲜鱼腥草中用水蒸气蒸馏法提取的挥发油类,加入增溶剂聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)及氯化钠调节为等渗过滤后灭菌而成,具有抗菌、抗病毒以及增强机体免疫力的药理作用,但是由于连续发生的严重不良反应,2006年SFDA叫停了鱼腥草注射剂使用。虽然鱼腥草注射剂的严重不良反应受多种因素的影响,但大量实验研究表明鱼腥草注射剂原成分及其代谢产物与增溶剂作为半抗原引起的机体超敏反应所产生免疫毒性是罪魁祸首,因此项目组前期展开了鱼腥草注射剂体内代谢研究,初步发现鱼腥草注射剂与新鱼腥草素钠注射剂存在“网通性”规律,尽管新鱼腥草钠的结构与鱼腥草注射剂中的挥发油有效成分类似,但为合成产物,因此本文想通过鱼腥草挥发油成分与其中之一的甲基正壬酮单体的代谢产物比较研究,进一步验证生物间的“网通性”代谢规律。1药品、化学品试剂气相色谱-质谱联用仪GC-MS-QP2010(日本岛津制作所),XK96-A快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司),台式离心机(长沙英泰仪器有限公司),分析天平(奥豪斯国际贸易上海有限公司),电炉(天津泰斯特仪器有限公司)。甲基正壬酮(110834-200502)、乙酸龙脑酯(110759-200303)、α-蒎烯(897-200001)均购于国家药品生物制品检定所。正十五烷(11677-200401)、正己烷(分析纯)为长沙国营延丰化学试剂厂生产;肝素钠溶液为上海山浦化工有限公司生产,其他试剂均为分析纯。大鼠,由湖南中医药大学实验动物中心提供,许可证号SCXK(湘)2001-2004,动物合格证号医动字第20-001号。2实验方法2.1柱流回收率kRtx-5MS石英毛细管柱(0.25mm×30.0m,0.25μm);柱温60℃;进样口温度250.0℃;分流进样,进样量2μL,分流比30∶1;柱压65.2kPa;总流量37.1mL·min-1,柱流速38.3cm·s-1,总保留时间56min;程序升温初温60.0℃,以2.00℃·min-1升至140.0℃,保持5min,再以10.00℃·min-1升至200℃,保持5min。质谱条件:EI离子源;进样口温度260℃;接口温度250℃;扫描范围m/z35～500;进样量1μL。2.2重蒸馏、重蒸取湖南怀化产鱼腥草2000g进行水蒸气蒸馏,收集初馏液2000mL,再进行重蒸馏,收集重蒸馏液约1000mL,加入7g氯化钠及5g吐温80,混匀,加注射用水使成1000mL,滤过,灌封,灭菌,即得。2.3甲基正醇注射液的制备在5.57mL蒸馏水(含0.7%氯化钠)中加入0.0278g吐温80,0.1mL甲基正壬酮,灭菌配成注射用溶液。2.4白色组用药在5.72mL蒸馏水(含0.7%氯化钠)中加入0.0286g吐温80灭菌配成注射用溶液。2.5供试品的制备取鱼腥草注射剂100mL,加碳酸氢钠使饱和,精密量取上清液50mL,置分液漏斗中,精密加入乙酸乙酯2.5mL,再加含22.048mg·L-1正十五烷内标液2.5mL,振摇5min,静置分层,分取有机层,缓慢滴加无水乙醇5滴以破乳,制得供试品。2.6-烯对照品溶液的制备精密称取正十五烷对照品5.5mg至250mL量瓶中,加乙酸乙酯溶解,定容,得22.0mg·L-1的正十五烷内标液,备用。精密称取甲基正壬酮对照品80.5mg至10mL量瓶中,加22.0mg·L-1的正十五烷内标液溶解,定容,得8.05g·L-1的甲基正壬酮对照品溶液,备用。精密称取乙酸龙脑酯对照品20.7mg至10mL量瓶中,加22.0mg·L-1的正十五烷内标液溶解,定容,得2.07g·L-1乙酸龙脑酯对照品溶液,备用。精密称取α-蒎烯对照品8.5mg至10mL量瓶中,加22.0mg·L-1的正十五烷内标液溶解,定容,得0.85g·L-1的α-蒎烯对照品溶液,备用。精密移取8.05g·L-1的甲基正壬酮对照品溶液、2.07g·L-1的乙酸龙脑酯对照品溶液和0.852g·L-1的α-蒎烯对照品溶液各100μL至10mL量瓶中,加14.0mg·L-1的正十五烷内标液,制得含80.5mg·L-1甲基正壬酮、20.7mg·L-1乙酸龙脑酯和8.5mg·L-1α-蒎烯的混和对照品溶液。2.7静脉和静脉联合用药正己烷-gs-ms法实验用大鼠18只,随机分成3大组,每大组再各分为2小组,每小组3只,实验前禁食8h,并给药前1周控制饮食,其中一小组口服给药,剂量为0.02mL·g-1,1.5h后断尾取血样;另一组静脉注射给药,剂量为0.002mL·g-1,1h后点断尾取血样,并置于-25℃下保存备用。取含待测药物的血浆于离心管(肝素抗凝)中,加入0.5mL正己烷,漩涡混合5min,5000r·min-1离心10min。吸取正己烷层,并通过GS-MS测定其成分。静脉注射空白血样供试品的制备同血样。3结果3.1烯保留时间吸取上述供试品液,进样量为1μL测得各成分,见图1。混合对照品图谱中的α-蒎烯的保留时间为6.621min,乙酸龙脑酯为25.300min,甲基正壬酮为26.001min。空白血样中主要出现癸羟基-2,6-甲基萘、癸羟基-2,3-甲基萘、4,6-二甲基-十二烷、及内标十五烷、十七烷等干扰化合物。3.2甲基-2-甲基乙酸酯的合成湖南怀化6月份鲜鱼腥草制得的一批注射剂中共有45种成分,相对含量较大,主要化学成分为甲基正壬酮、4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-环己烯-1-醇、α,α-4-三甲基-3-环己烯-1-甲醇、β-月桂烯、2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯-2-醇、乙酸龙脑酯、1-壬醇和1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-基乙酸酯等成分,见表1。各批次成分变化较大,大约70%左右的成分为共有特征峰。3.3血液样本的gc-ms分析3.3.1主要代谢产物大鼠口服鱼腥草挥发油注射液1.5h后,血液中分别可检出53种代谢产物,见表1,图1,其中α-蒎烯、β-月桂烯、甲基正壬酮、乙酸龙脑酯、3,7-二甲基-癸烷、薄荷醇(5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己醇)、十六烷、1-十二烷醇为主要代谢产物。3.3.2代谢产物及代谢产物大鼠注射鱼腥草挥发油注射液1h后,血液中分别可检出52种代谢产物,见表1,图1,其中α-蒎烯、β-月桂烯、1,4-二甲基-环己烷、4-甲基-辛烷、异十三烷醇、十二烷、1-甲基癸烯、5-甲基-2-(1-甲基乙基)-环己醇、2-甲基十七碳烷、1-十二烷醇为主要代谢产物。3.3.3代谢产物及代谢产物大鼠口服甲基正壬酮注射剂1.5h后,血液中分别可检出68种代谢产物,见表1,图1,其中α-蒎烯、β-月桂烯、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮、薄荷醇(5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己醇)、4-甲基辛烷、2-甲基十氢萘、异十三烷醇1-十二烷醇、2-己基-1-癸醇等为主要代谢产物。3.3.4代谢产物及代谢产物大鼠静脉注射甲基正壬酮注射液1h后,血液中分别可检出42种代谢产物,见表1,图1,其中α-蒎烯、β-月桂烯、己醛、甲基正壬酮、异十三烷醇、薄荷醇(5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己醇)、2-己基-1-癸醇、1-十二烷醇等为主要代谢产物。4讨论4.1口服、甲基正壬酮注射液的输注后鱼腥草挥发油注射血样的变化4种血样代谢产物与鱼腥草挥发油注射剂的原成分相同较少,只有含量高的α-蒎烯、β-月桂烯均能在4种代谢产物中找到,而甲基正壬酮在鱼腥草注射剂的口服、甲基正壬酮注射剂的口服或注射的血样中出现,而在鱼腥草挥发油注射血样不出现;口服的比注射的血样中的代谢产物要多,相似的成分也多一些;中药成分的代谢明显不同于化学药物的代谢,多成分与单成分的代谢产物基本持平,甚至还要多,如口服甲基正壬酮产生了69种代谢产物,因此,不管中药复方还是单味成分,其调节都是整个代谢网络,因此本实验的结果将对传统的将中药复方与单成分作用割列的观点提出了挑战。4.2鱼腥草注射液主要代谢产物鱼腥草注射剂原成分与血样的代谢产物进行两两比较分析,结果见表2。鱼腥草注射剂原成分在4种血样中出现的并不多,而以代谢产物为主。4种血样中均出现的代谢产物有α-蒎烯、β-月桂烯、薄荷醇、异十三烷醇4个化合物,其中α-蒎烯、β-月桂烯为原注射剂中成分;3个血样中的代谢产物有己醛、4-羟基-3-已酮、2,4-二甲基-庚烷、甲基正壬酮、2-己基-1-癸醇、1-十二烷醇、2-甲基-十三烷、2-甲基十七烷8个化合物;2个血样中的化合物有1,4-二甲基-环己烷等11个化合物,两两代谢产物相同的最低为鱼腥草挥发油注射剂注射样品与甲基正壬酮注射剂口服样品,占10.2%,最大者为甲基正壬酮注射剂注射样品与其口服样品,占28.6%,同时鱼腥草注射剂原成分中有8个在共代谢产物中检出,占17.8%,鱼腥草挥发油注射剂口服血样出现共有代谢产物18个,占34%;鱼腥草挥发油注射剂注射血样出现共有代谢产物13个,占25%;甲基正壬酮注射剂口服血样出现共有代谢产物17个,占24.6%;甲基正壬酮注射剂注射血样出现共有代谢产物15个,占35.7%;四者平均为29.8%。因此有近1/3的代谢产物为共同代谢产物,因此在中药多成分与单成分的代谢中存在相同或相似的代谢通路。4.3网络代谢产物的表达扣除表1中各样品血样的相同的代谢产物,鱼腥草挥发油注射剂口服血样出现非共有代谢产物35个,占66%;鱼腥草挥发油注射剂注射血样出现非共有代谢产物39个,占75%;甲基正壬酮注射剂口服血样出现非共有代谢产物52个,占75.4%;甲基正壬酮注射剂注射血样出现非共有代谢产物27个,占64.3%,四者平均为70.1%。因此有近2/3的代谢产物为非共同代谢产物,但均为单萜、倍半萜与脂肪族类挥发性成分,亦为同一代谢网络的同母核衍生物,因此中药多成分与单成分居相同的网络代谢,各自的代谢产物有其特异性,但均受网络整体调控,表现出网络调控的普遍性与成分特异表位决定族的有机结合,就如同机体对抗原免疫产生的抗体,由可变特异区与不变的稳定区构成,最终产生结构相似的特异性多克隆抗体群。因此研究中药代谢应将普遍性与特异性结合,既重视单成分的代谢产物的研究,更要重视各类成分群,如蒽醌、黄酮、糖类、香豆素、本脂素、挥发油、萜类、生物碱等成分群的代谢网络的研究,从中找出“网通性”的普遍代谢规律。4.4血样共有代谢产物鱼腥草挥发油注射剂口服与注射血样出现共有代谢产物8对,占15.4%;甲基正壬酮注射剂口服与注射血样出现共有代谢产物12对,占28.6%;鱼腥草挥发油注射剂与甲基正壬酮注射剂口服血样出现共有代谢产物13对,占18.8%;鱼腥草挥发油注射剂与甲基正壬酮注射剂注射血样出现共有代谢产物8对,占19.1%。中药口服和注射的代谢产物差异与多成分及单成分同一种给药方式的代谢产物一样,因此慎重对等中药注射剂的使用是正确的。4.5网络引导药物代谢产物的激活药物在体内经过氧化、还原、水解等反应生成极性较大的Ⅰ相代谢产物,直接排出体外或进一步与内源性物质葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽等结合增大极性,使之以Ⅱ相代谢产物的形式排出体外,本研究发现各血液中的代谢产物均未与内源性物质葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽等结合,说明鱼腥草挥发油在大鼠体内主要以Ⅰ相代谢产物的形式存在;并且代谢产物基本上也属于脂肪与萜类挥发性成分,与原植物的挥发油成分结构母核相似,推断鱼腥草挥发油注射剂或甲基正壬酮注射剂在体内除了按正常被CYP450肝药酶代谢外,可能还激活了与原植物相似,机体内的脂肪族、萜类挥发油异戊二烯的代谢途径,当鱼腥草的挥发性成分进入机体,不管是单味还是复合物,都能激体机体内本身潜在固有或者相似的代谢途径,产生相似的网络调控作用,促使同一网络相同或相似代谢产物产生。对于所作用的网络有相对固定的标志性成分,如对于鱼腥草挥发油成分代谢网络的标志性成分有萜类,如α-蒎烯、β-月桂烯、薄荷醇、乙酸龙脑酯、β-芳樟醇等;有脂肪簇类,如己醛、2,4-二甲基-庚烷、4-甲基辛烷、甲基正壬酮、2,3-二甲基-壬烷等,因此中药的同母核衍生物具有相似相近的作用。但不同成分组合,不同的给药方式,药物的代谢产物存在差异,主要是由于所给药物的结构不同,进入网络的入口不同,激活程度或产生的代谢产物不同;口服给药要经肠道水解、吸收,还受肠