全蝎莲藕对胶原免疫性关节炎大鼠il-2表达的影响

全蝎莲藕对胶原免疫性关节炎大鼠il-2表达的影响

类风湿性关节炎（ra）是一种以自身疾病为基础的慢性性免疫疾病，主要以四肢发育不良。它具有慢性、炎症、进展性、对称性、侵蚀性和坏死性特征。近年来调节性T细胞的功能失调或数量的下降,常导致包括RA在内的各种自身免疫性疾病的发生,日益受到人们的重视,调节CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞水平有望成为RA治疗的新的策略和途径,以蛋白成分为主的全蝎蜈蚣在RA中医药治疗中广泛运用,而且笔者以前的实验也已经证明,全蝎蜈蚣可有效缓解CIA大鼠的关节肿胀,降低关节损伤评分,但其能否调节CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞水平尚不明确。1材料和机器1.1实验动物及其制备大白鼠60只,雌性,体质量(160±20)g,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,合格证号:SCXK(沪)2008-0016。清洁级动物房饲养,适应性喂养1周后开始试验。1.2试验试剂全蝎、蜈蚣购于江西省黄庆仁华氏大药房,全蝎(Scorpio)为钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥体,产于山东;蜈蚣(Scolopendra)为大蜈蚣科少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的全虫体,产于江苏,经江西中医学院中药鉴定教研室鉴定合格。各等分研末,加适量生理盐水混匀,浓度为0.4g/mL,置4℃下冰箱保存备用。液态牛CⅡ(批号:2002-2)、CⅡ冻干粉(批号:2002-1)及不完全弗氏佐剂(批号:7002)均购自Chondrex公司。APC-抗CD4mAb(IgG2a)、PE-FoxP3mAb、IL-2酶联免疫吸附试验试剂盒均购于Bioscience公司。FITC-抗CD25mAb(IgG1)购于Biolegend公司。红细胞裂解液pharMLyseTM为美国BD公司产品。1.3仪器LD5-2A离心机(长沙湘仪离心机有限公司),流式细胞仪为美国BD公司FACSCalibur型。2全蟹麻黄清血指标检测2.1大鼠CIA模型的建立参照文献进行复制,即将液态CⅡ与等量完全弗氏佐剂混合(CⅡ的终浓度为1mg/mL)。用高速搅拌仪在冰浴状态下混匀,直至混合物完全、充分乳化(以乳化物滴入水中不松散为度)。取乳化后的混合物于大鼠尾根sc,0.1mL/只,注射后第7d,以相同剂量、相同部位再次免疫,即造模成功。2.2实验分组及给药将雌性Wistar大鼠60只随机分为6组,即正常对照组、模型对照组、全蝎蜈蚣高、中、低剂量组和Ⅱ型胶原蛋白治疗组(CⅡ组)。于第8d,按体重换算,全蝎蜈蚣高、中、低剂量组分别给予全蝎蜈蚣混悬液0.4g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg,CⅡ组予Ⅱ型胶原蛋白冻干粉60μg/kgig;正常对照组和模型对照组分别用等容积生理盐水ig,连续给药40d。2.3外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg的流式细胞术检测摘眼球取血,肝素抗凝收集;取血100μL,加入含有0.5μLCD4-FITC和2.5μLCD25-APC单克隆抗体的离心管中,室温避光孵育30min;加入1mL红细胞溶解液混匀,以1500r/min离心5min,弃其上清液;加入1mL透化缓冲液(1×),以1500r/min离心5min,以试管底部不见红色为度;弃其上清液,加固定/透化工作液500μL震匀,4℃下避光孵育12h(或过夜)。加流式染色缓冲液以1500r/min离心5min,清洗,于上述细胞悬液,加入含有1μLFoxP3-PE单克隆抗体(设IgG2α为同型对照)震匀,室温避光孵育30min,加流式染色缓冲液清洗,加0.1moL/LPBS调定至300μL,上流式细胞仪检测。2.4酶联免疫法(ELISA)检测血清IL-2表达水平眶后采血,1500rpm/min离心15min制备血清,参照试剂盒的说明书检测血清中IL-2的含量。待测上清液、标准品、检测抗体使用量均为100μL,波长450nm下测定吸光度值。2.5统计学分析检测结果均以x¯±sx¯±s表示,组间比较采用t检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.1cd4+cd25+t细胞的表达分析采用三色荧光法标记进行流式细胞术检测发现,与正常组比较,模型组大鼠外周血CD4+CD25+T细胞水平显著下降,CD4+CD25+T细胞中FoxP3+T表达水平明显下降(P<0.05或P<0.01),CD4+CD25+FoxP3-T和CD4+CD25-FoxP3+T表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,全蝎蜈蚣高、低剂量组及阳性对照组(CⅡ组)大鼠外周血CD4+CD25+T细胞水平显著升高,同时CD4+CD25+T细胞中FoxP3+T表达水平明显升高,CD4+CD25-FoxP3+T表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01);且CⅡ组CD4+CD25+FoxP3-表达水平显著下降(P<0.05)。而全蝎蜈蚣中剂量组除CD4+T细胞及CD4+CD25-FoxP3+T显著下降外(P<0.01),余无明显变化。3.2全蟹瞳花茶苷对外周血il-2表达的影响与正常组(73.9±3.52pg/mL)比较,模型组外周血血清中IL-2表达水平(81.3±7.39pg/mL)明显升高(P<0.05),同时全蝎蜈蚣中、低剂量组大鼠外周血血清中IL-2表达水平(71.7±2.46pg/mL,73.4±4.38pg/mL)显著下降(P<0.05或P<0.01),全蝎蜈蚣高剂量组(78.2±6.18pg/mL)及CⅡ组(76.2±4.95pg/mL)则作用不明显。4cd4+cd25+调节性t细胞ccr-1,发展il-2自CD4+CD25+T细胞被发现以来已有研究表明,无论是在人类,还是鼠类关节炎模型中,CD4+CD25+Treg的数量减少或功能异常可能导致类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生。而增加CD4+CD25+调节性T细胞表达可预防自身免疫疾病的产生,表明这类T细胞介导的免疫调节作用是维持自身免疫耐受的关键。FoxP3(ForkheadboxP3,FoxP3)则是目前公认的CD4+CD25+调节性T细胞的特异性标志,研究表明FoxP3基因表达水平调控着CD4+CD25+Tregs细胞产生与成熟,FoxP3基因一旦被破坏或缺失,CD4+CD25+Tregs细胞数量及成熟程度将明显下降,机体免疫耐受被破坏,形成自身免疫性损伤,最终促使自身免疫性疾病的发生,因此观察CD4+CD25+调节性T细胞及其特异性标志物(FoxP3)在人类类风湿性关节炎发病和治疗中的作用,日益受到人们的关注和重视。IL-2则是Treg行使抑制功能必不可少的因子之一,通过Treg与效应性T细胞竞争IL-2,从而有助于发挥抑制作用。本研究结果表明CIA大鼠存在CD4+T细胞水平显著升高,同时其亚群CD4+CD25+T细胞水平显著下降,CD4+CD25+T细胞中FoxP3+T表达水平明显下降,同时IL-2水平显著升高,说明CIA大鼠外周免疫耐受被打破,自身免疫应答形成,造成自身免疫性损伤,而全蝎蜈蚣在一定剂量下可降低CD4+T细胞水平,同时升高CD4+CD25+T细胞水平和CD4+CD25+T细胞中FoxP3+T