低剂量prcl3对胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响

低剂量prcl3对胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响

在动物实验中发现，腹腔注射、胃注射和尾注射的低剂量为lacl3或ybcl3。30天后，大鼠血清的胰岛素水平显著增加。本实验应用细胞培养、放射免疫检测技术、免疫组织化学技术及电子显微镜技术研究了PrCl3对大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素的影响。1材料和方法1.1血清rpmi字型根据本实验室胰岛细胞培养方法,于无菌条件下取3~4周龄Wistar幼鼠胰腺,剪成1mm3左右的组织块,用0.2U/LV型胶原酶消化,消化产物经108μm孔径的尼龙筛网过滤,收集滤过物,洗涤后加入含有15%小牛血清的RPMI1640培养液,置于培养瓶中培养。24h后,倒出细胞悬液,低速离心收集细胞,以每孔1.5×104个细胞团接种于24孔培养板内,置入5%CO2培养箱中,37℃条件下进行培养。1.2免疫组化检测胰岛素水平胰岛细胞培养48h后,随机将细胞分为对照组和PrCl3组,设PrCl3浓度为0.1,0.01,0.001和0.0001mmol·L-1,每组10个培养孔。继续培养24h后,收集各组培养孔内上清液,用放射免疫法检测其内胰岛素含量。根据胰岛素测量结果,选择与对照组相比有显著性差异的实验组及对照组,应用SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)进行免疫组织化学染色。以胰岛素抗体作为一抗,DAB显色,以细胞质内染成棕黄色为阳性结果。收集细胞悬液,用Hanks液洗涤,2.5%戊二醛液固定2h,0.1mmol·L-1PBS液冲洗,1%锇酸后固定2h,双蒸馏水冲洗两次,醋酸双氧铀块染,系列酒精脱水各15min,入无水丙酮15min,洗涤2次,环氧树脂经浸透、包埋、硬化、修块、切片、染色。于JEM-1200EX型透射电镜下观察β细胞形态结构。各组实验结果用X±S表示,实验组与对照组间差异用方差分析进行F检验。形态定量分析的阳性率用X2检验。2结果2.1prcl3浓度对上清液胰岛素浓度的影响培养液中加入低剂量的PrCl324h后,实验组上清液中胰岛素含量均高于对照组,随PrCl3浓度的增加,上清液中胰岛素浓度相应增多。其中0.01和0.1mmol·L-1组上清液中胰岛素含量分别为101.92mIU/L和106.64mIU/L与对照组(75.37mIU/L)相比有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。2.2免疫组织化学染色的观察2.2.1细胞数目检测β细胞散在或分布于细胞团中。细胞圆形、核圆形位于细胞中央。在400倍视野下依次观察5000个以上细胞,计数其中β细胞的数目,求出β细胞所占百分比,其中0.01和0.1mmol·L-1组中β细胞数目所占比例分别为81.80%和80.21%,均高于对照组(72.40%),具有显著性差异(P<0.05)。2.2.2各组细胞团内细胞数目和计数细胞团内β细胞分布无规律,有些β细胞分布于细胞团周边,有些分布于细胞团内部。计数各组3张切片标本中,所有细胞团内细胞总数及β细胞数目,计算出β细胞所占百分比,其中0.01和0.1mmol·L-1组中细胞团内β细胞数目所占比例分别为32.85%和40.43%,均高于对照组(22.93%),且具有显著性差异(P<0.05)。2.2.3细胞分裂指数在400倍视野下依次计数2000个以上β细胞及其中的细胞分裂相,并求出有丝分裂指数,结果见表1。β细胞有丝分裂指数在0.01和0.1mmol·L-1实验组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。2.3颗粒外包质膜对照组β细胞呈圆形,细胞膜完整,粗面内质网及高尔基复合体发达,分泌颗粒外包质膜,中心为大小不等的圆形或椭圆型结晶小体,结晶小体与质膜之间有较大的空隙。实验组中β细胞形态与对照组无明显差异,实验组β细胞周围尚可见到一些无分泌颗粒细胞。3prcl3对细胞增殖和分化的影响低剂量稀土对内分泌系统具有重要的影响。以往的系列研究工作已证明低剂量稀土氯化物能使大鼠血清中生长激素和胰岛素水平升高,并能促进体外培养腺垂体促生长激素细胞合成和分泌功能增强,对非胰岛素依赖型糖尿病大鼠也有显著治疗效果。本实验应用体外培养大鼠胰岛细胞,观察了低剂量PrCl3对β细胞的形态结构和功能的影响,证实低剂量的稀土氯化物同样可以直接作用于β细胞,并影响其分泌胰岛素。放免结果表明,这种促进作用与PrCl3的浓度有关。0.01和0.1mmol·L-1的PrCl3可以明显促进体外培养的胰岛β细胞分泌胰岛素,而当PrCl3浓度低于0.01mmol·L-1时则无此作用。由于受实验中选择剂量的限制,浓度高于0.1mmol·L-1时,PrCl3对β细胞是否具有同样的促进作用尚需进一步研究证实。通过形态学观察结果,可以推断实验组培养液内胰岛素含量高于对照组的原因,与实验组中β细胞数目密切相关。低剂量的稀土离子可能通过增加β细胞数目,使胰岛素合成增多,进而增加了胰岛素的分泌量。0.01和0.1mmol·L-1组β细胞数目明显高于对照组。培养细胞数量的增多可来源于以下两个方面:一是源于细胞的有丝分裂,二是源于干细胞的成熟和分化。由实验结果可见,这两个实验组中β细胞有丝分裂指数无明显升高,说明β细胞数目的增多不是来源于细胞的有丝分裂。这使我们注意到培养孔内的细胞团。0.01和0.1mmol·L-1组中细胞团内的β细胞数目也明显高于对照组,而且许多细胞团周边有β细胞分布,并围成完整的环行,这与正常情况下β细胞应位于胰岛中央的分布情况不符,说明培养孔内的细胞团不同于体内的胰岛;同时,在透射电镜下也观察到β细胞周围有相当数量的无分泌颗粒的细胞,这种细胞与Amory等提出的具有分化潜能的干细胞相似。以上结果提示细胞团内的细胞可能具有分化潜能,与β细胞的增殖和分化有关,低剂量的PrCl3能够促进这些细胞成熟和分化,使实验组中β细胞数目增高,进而使胰岛素合成增加。有关低剂量稀土离子促进β细胞分泌胰岛素的作用机制仍需做进一步研