3.(1)重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修3

从社会中来

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。非转基因番木瓜转基因番木瓜第三章

基因工程指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平原理结果重组DNA技术生物体外基因DNA分子水平人们需要的新的生物类型和生物产品基因重组1．基因工程的概念：p67基因工程从社会中来

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。

DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？非转基因番木瓜转基因番木瓜3.1重组DNA技术的基本工具学习目标：

阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。课标要求：

理解基因工程是一种重组DNA技术，阐明限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体三种基本工具的特点及在实现重组DNA中的作用。2．基因工程的诞生和发展(1)基因工程的诞生①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质是________，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。②1953年，沃森和克里克建立了___________________模型并提出了遗传物质自我复制的假说。③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的____________。④20世纪70年代初，多种限制酶、_____________酶和逆转录酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。⑤1973年，科学家证明__________可以作为基因工程的载体，构建____________，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。DNADNA双螺旋结构密码子DNA连接质粒重组DNA基因工程的诞生与发展(2)基因工程的发展①1982年，第一个基因工程药物___________________被批准上市。②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条

_______________。③1985年，穆里斯等人发明______，为获取目的基因提供了有效手段。④1990年，__________计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。⑤21世纪以来，科学家发明了多种_________________，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因序列的了解。⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的__________技术编辑了哺乳动物基因组。重组人胰岛素转基因鱼PCR人类基因组高通量测序技术基因组编辑3.1重组DNA技术的基本工具重组DNA技术的基本工具：（三）分子运输车---分子运输车（一）分子手术刀---分子手术刀（二）分子缝合针---限制性内切核酸酶DNA连接酶载体一、限制性内切核酸酶

——“分子手术刀”

简称：1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来

2、种类：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。3、作用特点：具有专一性4、作用部位:特定切点上的磷酸二酯键5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯键①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②能够切割特定序列中的特定位点。限制酶切点（消耗水）5.限制酶的识别序列的特点(1)EcoRI、SmaI限制酶的识别序列均为6个核苷酸(2)少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成EcoRI(在G与A之间切割)SmaI(在G与C之间切割)5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端6、结果：产生黏性末端或平末端被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。(3)限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开黏性末端黏性末端（1）EcoRI限制酶的切割:被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。3、两种常用的限制酶：EcoRⅠ和SmaⅠ3、EcoRⅠ和SmaⅠ识别的序列分别是什么？切割位点是什么？得到什么结果（有什么形式）？只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开平末端

平末端产生黏性末端或平末端3、得到什么结果（有什么形式）？（2）SmaI限制酶的作用当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开1、各小组之间合作尝试找出手上DNA片段中EcoRⅠ识别的序列，以及切割位点，用剪刀进行切割。2、在这里剪刀代表什么“分子工具”？如何确定是同一种酶切割的？探究活动一:限制性内切核酸酶----“分子手术刀”（3min）3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'将一个黏性末端旋转180°，若相同则说明是同一种酶切割产生的5'-TAATAGAATTCT

CGGTATGAATT

C

CATAC-3'3'-ACCATCTTAAGAGCCATACTT

AAGGTATG-5'学案P42典例剖析某DNA分子中含有某限制酶的1个识别序列,用该限制酶切割该DNA分子,可能形成的2个DNA片段是(

)A.①②

B.③④C.①③

D.②④B学案P42学以致用下图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和切割位点图(箭头表示切割位点,切出的断面为黏性末端)。下列叙述错误的是(

)A.不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点,体现了酶的专一性B.限制酶2和限制酶3的识别序列均为6个核苷酸C.限制酶1和限制酶3切割得到的黏性末端相同D.能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2D拓展应用（书本P74）1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。

微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源人侵的DNA切割降解，使之以保证自身安全。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并目可以防止外源DNA入侵3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'5'-TAATAGAATTCT

CGGTATGAATT

C

CATAC-3'3'-ACCATCTTAAGAGCCATACTT

AAGGTATG-5'探究活动二:DNA连接酶----“分子缝合针”阅读教材72-73页，思考讨论下列问题(5min)动手：小组合作将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。讨论1、在这里透明胶条代表什么“分子工具”？如何确定切割得到的黏性末端可以连接？2、产生了什么的结果？3、常见的种类？有何区别？

两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来作用：可将切下来的DNA片段“缝合起来”，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。讨论1、在这里透明胶条代表什么“分子工具”？如何确定切割得到的黏性末端可以连接？DNA连接酶18讨论2、产生了什么的结果？3、常见的种类？有何区别？二、DNA连接酶----“分子缝合针”拼接成新的DNA分子种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别

1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是()A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氨键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端一、概念检测练习与应用（P74）书本P72旁栏：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？DNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATT连接两个DNA片段3.与DNA聚合酶区别：CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键任务驱动二:比较DNA连接酶与DNA聚合酶什么化学键根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键温故知新：判断：1.限制酶和DNA解旋酶的作用部位相同（

）2.DNA连接酶能将两个碱基通过氢键连接起来（

）××催化合成RNA1、载体的作用？2、载体的种类有哪些？3、质粒的本质是什么？质粒做载体必须满足哪些条件？任务驱动三:基因进入受体细胞的载体----“分子运输车”阅读教材72-73页，思考讨论下列问题(3min)将外源基因送入受体细胞本质：一种裸露的、结构简单的、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的环状双链DNA分子。质粒质粒（最常用）动植物病毒噬菌体种类：（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存（2）有一个至多个限制酶切点（3）有某些标记基因（4）对受体细胞无害、易分离能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；便于与不同目的基因结合便于鉴定和筛选有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4、运载体需具备的条件2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是()A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针一、概念检测A练习与应用（P74）学案P43：学以致用学案P43：学以致用限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是

和

。下图表示四种质粒和含目的基因的DNA片段,其中箭头所指部位为限制酶的切割位点,质粒的阴影部分表示标记基因。下列适于作为图示目的基因载体的质粒是(

)A1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。方法总结：---选择酶切位点的原则思考·讨论重组DNA分子请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。1.剪刀和透明带分别代表哪种“分子工具”？书本P73限制酶DNA连接酶思考·讨论2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？书本P733.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？可能是剪切位点或链接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。不能，真正的基因是具有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…实例：重组DNA分子的模拟操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…思考·讨论1．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？2．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ,XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spel切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？xbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端二.拓展应用练习与应用（P74）（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？

识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。

同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。二.拓展应用练习与应用（P74）6.下图为DNA分子的切割和连接流程图。请回答下列问题。

(1)EcoRⅠ是一种

酶,其识别序列是

,切割位点是

与

之间的

键。(2)将不同来源的DNA片段拼接成新的DNA分子,需要的酶应是

。图中此酶催化

与

之间形成

键,从而将不同来源的DNA片段拼接在一起,构成

。

限制GAATTCGA磷酸二酯DNA连接酶GA磷酸二酯重组DNA分子学案P44随堂6.课时训练P15：88.下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图。据图回答下列问题。(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同,都是

,二者还具有其他共同点,如①

,②

。

(2)若质粒DNA分子的切割末端为—A—TGCGC,则与之连接的目的基因切割末端应为

;可使用

把质粒和目的基因连接在一起。

(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为

,其作用是

。

(4)下列常在基因工程中用作载体的是

。

A.苏云金杆菌的抗虫基因B.土壤农杆菌的环状RNA分子C.大肠杆菌的质粒D.动物细胞的染色体DNA能够自我复制具有遗传效应CGCGT—A—DNA连接酶标记基因便于重组DNA分子的筛选C限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、λ噬菌体衍生物

、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类:磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4

DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来

【课堂小结】DNA的粗提取与鉴定一、实验原理：1．提取DNA的原理利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。2．鉴定DNA的原理在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。二、材料用具1.选材：注意：2.试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用1．称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。2．去除滤液中的杂质方案一在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液方案二直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液三、方法步骤3.DNA的析出方案一在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分方案二将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干4.DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试