临床实验室精液常规检验中国专家共识

最新：临床实验室精液常规检验中国专家共识

摘要

男性精液常规检验是评估男子生育力的重要方法，也是男科疾病诊断和治

疗的重要实验依据。精液检验结果受射精频度、温度、实验室条件、检验

人员技术熟练程度和主观判断能力等诸多因素影响，其结果易发生偏差。

目前，男性精液检验的质量控制和结果应用缺乏明确的指南或专家共识指

导。为提高对精液检验的认识，规范精液检验的选择和应用，中国中西医

结合学会检验医学专业委员会发起并组织业内专家成立编写组，结合近年

来国内外相关领域研究进展，制定人类精液检验专家共识，供临床医师和

检验医师参考。

精液是运送精子的复合液，主要为睾丸、附睾、精囊、前列腺和尿道球腺

分泌的液体，主要由精子和精浆构成。精液常规检验是临床实验室，尤其

是男科实验室，或生殖医学实验室最为基础的检查项目，可用于确定男性

生育状态，是男性不育评估的首选项目。精液常规检验结果正确度关系到

患者治疗方案的选择和辅助生殖技术治疗措施的选用，必须进行对实验室

操作标准化，以保证检验结果准确性，最大限度满足临床诊疗需求。

针对目前国内缺乏规范化的精液常规检验专家共识或指南的现状，2019

年6月28日在成都举行的第六次全国中西医结合检验年会上，中国中西

医结合学会检验医学专业委员会生殖医学专家委员会与会专家一致倡议

并启动了"临床实验室精液常规检验中国专家共识”项目。由常委单位河南

省中医院（河南中医药大学第二附属医院）牵头，联合北京中医药大学东

直门医院等7家主委或常委单位，组织本领域相关专家起草本共识。基于

临床实践、文献综述、专家研讨等方式凝练总结，分别于2020年11月

13日在济南举行的第七次全国中西医结合检验年会和2021年7月24日

在合肥举行的第八次全国中西医结合检验年会上，经过多轮专家会议反复

论证，2022年1月26日又通过线上会议进行了讨论定稿，形成本共识。

通过对精液常规检验实验室操作流程和结果解读提出建议，以促进临床实

验室精液常规检验的标准化和规范化，更好地服务临床诊疗。

本共识参考《世界卫生组织人类精液检杳与处理实验室手册（第六版）》

[1],结合国内男科学、生殖医学和检验医学等领域临床实验室精液常

规检验相关权威文献[2,3,4,5,6,7,8],对精液常规检验的应用范围、

采集与处理、理学检查、化学检验和有形成分分析以及新兴检测指标规范

使用等方面进行分析和总结，旨在进一步规范精液常规检验的实验室操作

和临床应用。本共识可为从事检验医学和男科学、生殖医学的医务人员提

供规范化的实验操作指导和专家咨询建议。

一、精液常规检验的应用范围

1.评价男性生育能力，男性不育症的原因及疗效观察。

2.男性生殖系统疾病的诊断和预后判断，如炎症、结核、肿瘤等。

3.随访输精管结扎术后的疗效。

4.评价捐精者精液质量，为人类精子库和人工授精筛选优质精子。

5.婚前检查。

6.法医学鉴定，如阴道分泌物中精子分析和DNA分析。

二、精液标本的采集与处理

（-）精液标本的采集

正确采集标本是保证检验质量的重要前提，精液采集要求如下。

1.采样前2~7d应严格禁欲（无性交、无手淫、无遗精）0如需多次采集，

每次禁欲天数应尽可能保持一致。3个月内至少检杳2次，2次间隔应超

过7d,但不超过3周。

2.选择恰当的精液采集方法。手淫法是最为妥善的方法，不提倡体外射精

法、电震动法、前列腺按摩法和安全套法。应将一次射精精液全部送检。

3.使用专用或指定清洁干燥广口带刻度容器收集精液。仅在特殊情况下，

可使用专门为采集精液而设计的专用避孕套来采集标本。

4.送检容器必须注明被检者姓名和/或识别号（标本号或条码），标本采集

日期和时间。

（二）精液标本的处理

实验室在收到标本后应记录留取时间，立即加盖保存于37℃水浴箱中观

察液化时间。精液内可能含有危险的传染性病原体[9,10,11],如乙型

肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和疱疹病毒等，故精液和相关使用过的器材应

按潜在生物危害物进行处理。

建议1:标本采集前，临床实验室应向患者提供关于精液标本采集的清晰

的书面和口头的指导及注意事项，强调标本采集的完整性，注意保护患者

个人隐私。

建议2:标本采集后，应在容器标签上记录禁欲时间、标本采集时间、标

本完整性。如果标本收集不完整，尤其是富含精子的初始部分精液丢失，

要在检验报告中注明，并在禁欲2~7d后重新采集标本进行检查。

三、精液理学检验

（-）精液理学检验程序

将盛有完整的精液标本的容器置于37。（：环境，待精液液化,30-60min,

评估并记录精液外观、精液量、黏稠度、液化时间、酸碱度、精子活力、

精子数量、精子存活率、精子形态学、混合抗球蛋白反应试验、过氧化物

酶试验、免疫珠试验或间接免疫珠试验、附属性腺标志物、病原微生物学

检测等。

（二）精液理学检杳内容

理学检查包括精液外观、精液量、黏稠度、液化时间和酸碱度等。

1.精液外观：正常精液外观呈均质性、灰白色或乳白色，不透明。精液呈

棕色或红色，提示红细胞存在；黄色见于黄疸患者和服用维生素或药物者。

若存在大量白细胞，精液明显混浊、透明度降低，当精子密度很低时，精

液近乎透明。

2.精液量：推荐称重法测量精液量，在接收到标本5min内完成。将收集

标本的广口瓶预称重（重量标在瓶身和瓶盖上），直接将标本留取到改良

的广口瓶后进行称重，减去瓶子重量，以1.01g/ml的精液浓度计算精液

量［12］。不推荐使用移液管、注射器和量筒测量精液体积。正常一次射

精量约为1.5~6.8ml。

3.黏稠度：精液完全液化后，使用Pausteur滴管法或玻棒法，观察拉丝

长度。正常精液形成不连续的小滴，拉丝长度小于2cm,黏稠度异常或

液体增厚时，拉丝长度大于2cm0根据液化和拉丝程度将精液黏稠度分

为3级：（1）1级，30min基本液化，呈黏稠丝状；（2）2级，60^1吊

不液化，呈粗大黏稠丝；（3）3级，24h不液化，黏稠性很高呈胶冻状。

4.液化时间：精液离体收集到容器后，通常在室温或37。（:孵育箱内几分

钟内开始液化，在15~30min内完全液化，可进行后续检杳。超过30min

不液化，应在37°C孵育继续放置30min,即60min后进行后续检查。

超过60min仍不能液化，则为异常，液化延迟或异常均应准确记录为液

化异常样本，可借助机械混合［13］或添加消化酶［14］等手段促进精液

液化，方便后续检查的进行。有时正常液化的精液标本含有不液化的胶冻

状颗粒，无临床意义。

5.酸碱度：应在精液液化后测量，宜在30min后进行。推荐使用测量范

围为6.0-10.0的pH试纸来测定酸碱度。正常精液pH为7.2~8.0（平均

为7.8）,呈弱碱性。pH<7.0并伴有精液量减少和精子数量减少，可能

存在先天性双侧输精管缺如和胚胎因素［15,16,17,18］0精囊腺缺失或

发育不良也可造成精液量减少和pH降低。pH>8.0,见于前列腺、精囊

腺、尿道球腺和附睾的炎症。

建议3:对于超过60min仍不液化精液标本，可进行机械混合或添加酶

消化剂，以便进行进一步分析。对液化异常标本，应在报告中注明液化处

理方式是机械混合还是使用酶消化剂。

四、精液显微镜检查

精液显微镜检查，或称精液有形成分分析，包括精子活动率、精子活动力、

精子计数、精子形态分析和精子凝集现象检查及其他有形成分检查等，需

采用标准化的操作和计数方能获得准确和可靠的结果。

（-）精子活动率

精子活动率是活动精子占精子总数的百分率。射精30~60min内精子活

动率达到80%~90%。活动率＜40%,应进行精子活体染色,检查精子的

存活率。常用检测方法为伊红-苯胺黑染色法和低渗肿胀试验来鉴别细胞膜

完整的精子，鉴别不动死精子和不动活精子，大量活而不动精子提示精子

尾部结构缺陷;大量死精子提示附睾存在疾病或感染所致免疫反应［19］0

总精子数25%~30%为活而不动精子，提示为遗传性纤毛问题［20］。

（二）精子活动力

精子活动力是评估男性生育能力的重要指标。检测常用传统显微镜法、连

续摄影法和精子质量分析法。（1）显微镜法：传统镜检方法受检验者的

主观影响因素较大；（2）连续摄影法：计算机视频显微照相术和实时显

微照相术可客观评价精子的活动力和形态；（3）精子质量分析法：WHO

推荐使用评估精子活力等级的简单系统。精子质量分析仪具有操作便捷,

准确、客观的特点，是较为理想的精子活力分析法。

WHO将精子活动力分为4级：（1）a级：精子快速向前运动,37℃,

精子速度225pm/s，或20°C,精子速度220pm/s;（2）b级：慢速

或呆滞地向前运动；（3）c级：非前向运动（精子速度＜5pm/s）;（4）

d级：不动。正常标本采集后60min内，250%的精子呈中度或快速直

线运动。但生理情况下，射精后数分钟精子离开精液进入宫颈黏液，因此

精子活动力评价的意义有限。

（三）精子计数

精子计数包括精子密度和精子总数。精液中精子浓度与受精率和妊娠率相

关，一次射精，精子数达到（20~250）x106/ml考虑为正常，减低或增

高均可引起不育。精子计数＜20x106/ml为少精子症；精液多次检杳无精

子时称为无精子症。WHO推荐血细胞计数板法进行精子计数，也可采用

精子专用计数板法。健康人的精子数量存在着明显的个体差异，同一个体

的精子数量变化范围也很大，受禁欲时间、病毒感染和精神压力等因素影

响。

（四）精子形态分析

精子形态分析采用计算机技术客观的评价精子头部长度、宽度、周长和面

积，但尚无公认的正常参考区间。严格来讲，只有头、颈、中段和尾部都

正常的精子才能称为正常精子。正常精子头部成椭圆形，长度4.0~5.0p

m,宽度2.5~3.5pm，顶体界限清楚，占头部40%~70%;中段细，长

度6~8pm,宽度不超过1pm;尾部长度至少45pm，细长无卷曲。精

子头部出现明显畸形、缺陷或不规则、空泡，颈部和尾部出现双尾、断裂、

弯折等，均可判定为异常精子。简单的形态学评价将精子分为正常和异常

两类。若进行全面详细形态学评价，可将精子分为5类：正常、头部缺陷、

颈部和中段缺陷、尾部缺陷、胞质小滴（位于精子中段，该区域大于正常

精子头部的1/3）0

WHO推荐使用巴氏染色法进行精子形态分析，也可使用Shorr■染色法或

Diff-Quik快速染色法，但需要与标准方法进行比对和验证。生育力正常

男性中，正常形态精子比例应超过50%，低于5%,多提示不育。生育者

正常形态精子多超过12%~15%,且生育组和不育组相比，精子头部长度

和宽度比率差异有统计学意义。不推荐使用湿片法精子形态检查，染色法

虽然操作相对复杂，但染色后精子形态易于辨认，结果准确性和重复性较

好。

（五）精子凝集现象检查

精子凝集时活动精子以各种方式（如头对头，尾对尾或混合型）相互黏附

在一起的现象。以分级方式报告。（1）1级：零散的，每个凝集＜10个

精子，有很多自由活动的精子；（2）2级：中等的，每个凝集＜10~50

个精子，存在自由活动精子；（3）3级：大量的，每个凝集＞50个精子，

仍有一些活动的精子；（4）4级：全部的，所有精子凝集，数个凝集又粘

连在一起。此外，也可以采用（无凝集）~"3+"（所有可动精子凝集在

一起）的形式报告。精子凝集现象的存在提示存在抗精子抗体，免疫球蛋

白G（IgG）和免疫球蛋白A（IgA）抗体与免疫学不育有密切联系，但需

进一步实验证明，如免疫珠试验、混合抗人球蛋白试验来鉴别抗体种类。

单凭此现象不足以推断免疫因素介导的不育症。

（六）精液中其他有形成分检直

正常精液中除精子外，还会出现其他细胞，如尿路上皮细胞、白细胞、未

成熟生精细胞，以及细胞碎片和各种颗粒。因这些细胞大小和细胞核形状

类似，存在鉴别困难。WHO推荐采用过氧化物酶染色来识别白细胞（过

氧化物酶阳性）、生精细胞、淋巴细胞（过氧化物酶阴性），从而鉴别感

染和不育症。此外，精液过氧化物酶常规检杳可作为基础的筛查手段[21]0

白细胞还可以借助免疫细胞化学检查进一步区分为正常白细胞和携带精

子抗原白细胞。过氧化物酶阳性细胞2lx106/ml,认为精液白细胞总数

存在异常，与感染和精子质量降低存在关联[22,23]0白细胞可以通过

氧自由基攻击影响精子活动力和DNA完整性。而白细胞渗透能够对精子

造成损伤依赖于一些无法从精液标本获得的信息，如渗透的时间和解剖学

定位以及白细胞本身性质和是否处于激活状态。

多形核白细胞会释放胞内颗粒，而其他类型白细胞，如淋巴细胞、巨噬细

胞或单核细胞胞内不含过氧化物酶，不能被邻甲苯胺染色，但可通过免疫

细胞化学途径实现。免疫细胞化学染色法与中性粒细胞过氧化物酶活性评

估相比，价格昂贵，较为费时，但可区分白细胞和精原细胞。

临床实验室可使用全白细胞抗体CD45+单克隆抗体对精浆中的细胞进行

染色以区分白细胞和生殖细胞。目前尚无生育能力正常男性人群精浆中

CD45+细胞浓度参考值，但普遍认为过氧化物酶阳性细胞＞1.0x106/ml,

提示精浆中白细胞总数较高。

建议4:精子活动力检杳是通过评估精子细胞膜的完整性，常规地确定所

有精子的生命力，但在总活动率为40%以上时，不建议进行此项检杳。

建议5:精子形态学检杳首选巴氏染色法,也可使用Shorr染色法或

Diff-Quik快速染色法。临床实验室必须建立本实验室标准操作方法和精

子形态判断标准，不推荐采用湿片镜检法进行精子形态学检杳。

建议6:精子凝集现象提示存在抗精子抗体，但单凭此现象不足以推断免

疫因素介导的不育症，需进一步进行相关实验室检查。

五、计算机辅助精子分析

随着科技的进步，计算机辅助精液分析(Computer-aidedsperm

analysis,CASA)和精子质量分析仪(Semenqualityanalyzer,SQA)

已得到应用，其高效、客观、高精度的特点在精液检查方面凸显优势。

（—）CASA

CASA系统既可定量分析精子浓度、精子活动率、精子活动力，又可分析

精子运动速度和运动轨迹特征。CASA系统对精子动力学分析具有独特优

势，其可检测和分析活动精子。然而值得注意的是，CASA对精子活动率

的评估并不可靠，因为计算精子活动率时，只有产生了一定位移的精子才

会被系统认定为活动精子，而对原地摆动的精子则判定为不活动精子，且

精液中的杂质可能会被误判为不动精子，从而低估精子活动率。诸多因素

可以影响CASA准确性，如样本准备情况、帧频、精子浓度和计数池深度

[24,25]0检查程序使用得当，可获得可靠的重复性强的结果。应当参

考CASA使用指南[26,27],对CASA设备的使用进行全员培训，同时

明确该技术的优缺点。

使用CASA获得运动参数，每份样本应对至少200个精子的活动轨迹进行

分析。如果对精子运动类型进行分类，或者计划分析样本变异性，应对至

少200个，最好400个活动精子分析。

采用CASA系统对精液进行检杳时，需注意以下几个问题：（1）精子浓

度在（2~50）x106/ml结果较为理想，精子浓度过高，标本应当稀释，

还应在培养基中加入0.3g/L牛血清白蛋白和1g/L葡萄糖，以防止因标

本稀释而造成精子运动性能改变；精子浓度过低时应增加检查视野；(2)

计算精子活动率时，精子只有发生了一定的位移，CASA才认为是活动精

子，而对原地摆动的精子则判定为不活动精子，其结果低于实际结果；(3)

CASA系统测定的是单个精子的运动参数，缺乏对精子群体的了解；(4)

CASA识别精子的准确性容易受到精液中的细胞和颗粒物质的影响。

(-)SQA

当光束通过液化的精液时，精液中精子的运动可引起光密度的变化，其中，

光密度变化包括频率和振幅的变化。通过检测光密度频率和振幅的变化量,

即可对精子质量进行判断。频率和振幅的变化量越大，则精子质量越好；

反之，则精子质量越差。SQA具有重复性好、客观性强、精密度高，操作

简便的优点，可以客观，快速地对精液质量进行评价，但目前仍不能完全

代替显微镜检查[28,29,30]0

建议7:精液常规分析首先采用CASA和SQA法进行筛杳,异常结果采

用人工显微镜检查方法进行复查确认。

建议8:每个实验室建立自己的标准化的质量控制体系，结合临床进行循

证医学研究，建立本实验室检测指标的参考范围。

六、精液化学检验

精液化学检验主要是指附属性腺生化检查。前列腺、精囊腺、尿道球腺是

男性的主要附属腺体，每个腺体分泌有不同的物质，发挥着其相应的功能,

通过检测精浆中的物质含量，可以评价腺体的功能状态。

（-）精浆果糖测定

通常采用间苯二酚法。正常＞13pmol/L次射精，减低见于精囊腺炎和雄

激素分泌不足；缺如见于先天性精囊腺缺如、逆行射精等。

（二）锌、枸椽酸、谷氨酰转肽酶和酸性磷酸酶

精液中锌、枸椽酸、谷氨酰转肽酶和酸性磷酸酶测定有助于前列腺分泌功

能的判断。常采用比色法或原子吸收光谱法测定锌，正常每次射精＞2.4M

mol/L[31]0枸椽酸是精液中主要阴离子，采用比色法进行定量测定，

若浓度降低，提示前列腺功能异常，正常每次射精＞52|jmol/Lo酸性磷

酸酶活性有助于判断前列腺分泌功能，正常每次射精2200U/Lo

（三）中性氏葡萄糖甘酶

中性氏葡萄糖昔酶对附睾疾病的诊断具有更高的特异性和敏感性[32]。

精液中出葡萄糖甘酶有两种亚型（中性和酸性），其中，中性亚型占比较

大，主要来自于附睾；酸性亚型占比较小，主要来自前列腺液。利用十二

烷基硫酸钠可选择性抑制酸性a-葡萄糖苗酶活性,从而测定精浆中中性a-

葡萄糖昔酶的活性，特异性地反映附睾分泌功能。中性氏葡萄糖甘酶的参

考值为每次射精＞23.1mU/L0有研究显示，长期禁欲或输精管结扎术后

的精液中a-葡萄糖甘酶的含量较高，特别是在锌含量较高的精液中，提示

前列腺来源a-葡萄糖甘酶与该检查存在交叉反应［33］。

（四）白细胞介素

男性生殖道慢性炎症是导致不育症发生的重要原因。生殖道感染或炎症患

者的精液的主要特征是白细胞数量超过1x106/ml和黏度增加，而最常见

的临床症状是慢性骨盆疼痛。生殖道感染或炎症可通过炎性细胞产生炎性

介质或氧自由基改变生殖道微环境破坏精子，从而损伤生育能力。多种细

胞，包括单核细胞、激活的T淋巴细胞和中性粒细胞可产生炎症趋化因子，

协同或加成作用于靶细胞。对于男科和泌尿科医师来说，对精浆中的趋化

因子和细胞因子进行测定对生殖道感染导致的男性不育诊断是必要的。

Penna等［34］对慢性前列腺炎患者精浆中8种细胞因子和9种趋化因

子进行筛选发现，精浆中IL-8水平同时具有较好的准确性和敏感性，是男

性生殖道感染或炎症最好的诊断指标。

（五）特异性抗体

精子出现凝集时需进行精子抗体检测。精浆中的抗精子抗体主要由IgA和

IgG2种类型构成。免疫球蛋白M由于其相对分子质量较大，主要在急性

时相感染中起作用，在精浆中鲜有发现。与IgG抗体比较而言，IgA临床

意义更大。而95%以上携带IgA抗精子抗体的患者，其IgG也为阳性。2

种类型抗体均可在针对精子细胞或生物体液的相关筛杳试验中发现。精子

抗体会严重影响精子功能，通常以精子-黏液穿透实验进行评估。抗精子抗

体可以影响透明带结合试验和顶体反应，也会损害精子穿透宫颈黏液的能

力［35］。

建议9:根据临床症状选择相应的检测指标，评价附属腺体功能。

建议10每个实验室应建立本实验室的精液化学检测方法的质量评价体系

和检测指标的参考范围。

七、其他相关检杳指标

（一）精子DNA完整性检测

精子DNA损伤被定义为DNA正常结构发生的任何化学改变，而以精子

DNA碎片化最为常见，以单链或双链断裂的形式影响遗传物质。精子DNA

碎片化可由多种生理过程引发，包括精子生发过程中DNA组装缺陷，和

多种病理因素与环境相关的细胞死亡和氧化应激［36,37,38］0虽然包

含精子DNA碎片的精子生育能力不受影响，近年来大量Meta分析报道

［39,40,41,42］，但DNA碎片化会影响自然受孕和辅助生殖的胚胎发

育、着床和妊娠。众所周知，DNA碎片化在精液参数异常男性中较为常

见，与精子量正常的不孕症患者高度关联。

末端脱氧核甘酸转移酶介导的脱氧尿嚓碇三磷酸(deoxyuridine

triphosphate,dUTP)末端标记技术(terminaldeoxynucleotidyl

transferasemediateddUTPnick-endlabeling,TUNEL)和单细胞凝

胶电泳分析可直接评估DNA单链和双链断裂情况，而口丫碇橙流式细胞术

和精子染色质扩散试验(spermchromatindispersion,SCD)可检测染

色质对酸处理的敏感性。

常规精液分析并不能完全反映精子是否具有正常的受精能力，也不能很好

地预测精子的受精潜能。曾有研究报道，不育男子连续2次标本中精子

DNA损伤的变异系数明显低于常规精液分析(精子密度、精子活动率)，

且同一份标本重复测定精子DNA完整性的变异系数＜5%。由此可认为，

精子DNA损伤分析是比传统精液常规分析参数更稳定、更敏感地预测男

性生育能力的指标［43,44］。每项检测的诊断阈值要根据所使用方法而

定。临床应用而言，合适的阈值应该根据实验室情况确定和验证。针对不

同个体诊断时，不仅要考虑到不同人种的相关性，在临床实际应用中还需

要与阳性预测值和阴性预测值相关数据来评估和保证其正确使用。

1.DNA完整性TUNEL检验：精子DNA碎片化检测最为常用的技术。通

常使用荧光染料或者生物素标记的dUTP在原位检测DNA链断裂情况。

精子DNA链断裂后，3'-0H末端暴露出来。后者作为引物，在一种模板

依赖DNA聚合酶与脱氧核糖核酸末端转移酶的催化作用下与荧光染料或

生物素标记的dUTP结合，从而标记出断裂位点[45,46]0TUNEL可联

合流式细胞术进行定量或荧光显微镜进行定性分析。然而，就临床样本的

高通量性质而言，TUNEL联合流式细胞术定量检测更为适用。使用荧光显

微镜，需要计数至少200个精子。有报道认为[47],TUNEL检测不同

步骤的变异会显著影响检杳结果。因此，临床实验室应该对该技术进行标

准化并建立本实验室的截断值。鉴于DNA损伤和精子活力的关联，整合

精子活力评估的改良TUNEL法也不断被引入，但诊断效能有待于进一步

验证[48,49,50]0

2.SCD:SCD是一种利用光学显微镜观察精子DNA对酸处理敏感性的试

验。SCD基于完整精子DNA在酸变性和核蛋白去除后可扩散形成中心密

度向四周递减的特征性光晕，而存在DNA碎片的精子不会产生这种特征

性的光晕。根据精子扩散光晕环大小分为：大晕环、中晕环、小晕环和无

晕环及降解的无晕环（核心不规则或弱染的无晕环），结果应报告各种晕

环精子的百分率，其中存在碎片DNA精子为拥有小晕环的总精子数，不

包括无晕环和降解的无晕环精子。目前，有关SCD临床应用的研究较为

有限。作为另一种DNA碎片化试验，临床实验室应该使用合适的质控，

基于阳性和阴性预测值，建立本实验室的参考范围[51]0

3.彗星实验：也称单细胞凝胶电泳实验。基于个体精子中断裂DNA链在

电场作用下由于大小和电荷差异而出现不同的迁移速率。电泳过程中，如

果DNA没有损伤，则将停留在原位，染色后呈圆形的荧光团，无拖尾出

现。如果DNA受损，断裂的碎片进入到凝胶中，在电场的作用下，DNA

碎片离开原位向阳极迁移，形成拖尾。DNA受损越严重，断裂越多，产

生的碎片就越多、越小，则向阳极迁移的DNA碎片量就越多，迁移距离

也越长，荧光染色后就能看见"彗星"样尾长并且荧光强度增强。可通过染

色借助软件计算尾部与头部的相对荧光比值来测量DNA损伤。与精子尾

部重叠的彗星不计数，无头部的彗星视为100%DNA损伤。不少研究［52,

53,54］已经报道了使用彗星实验进行DNA完整性评估的诊断阈值，但

差异较大，很大程度上依赖于具体实验方法选择和判定结果所使用到的技

术手段。作为精子DNA完整性评估的一种方法，临床实验室应基于阳性

和阴性预测值，清楚与预测值价值关联的因素（如妊娠、流产和其他情况）,

使用合适的质控体系建立本实验室的参考范围。

4.叶陡橙流式细胞术：本方法基于叶咤橙插入双链DNA后可激发绿色荧

光，而插入单链时则为红色荧光。借助流式细胞术收集红色和绿色荧光数

据，并转化为精子群体中红色荧光的表达度，即DNA碎片指数，可借助

任何流式细胞软件实现。口丫陡橙流式细胞术DNA碎片指数已有报道评估

生育力［55,56］,但临床实验室应基于阳性和阴性预测值，清楚与预测

值价值关联的因素（如妊娠、流产和其他情况），使用合适的质控体系建

立本实验室的参考范围。

（—）顶体反应

精子顶体结构的完整性和进行顶体胞外分泌对维持正常的生育能力是必

须的。顶体反应是一项在体内进行的精子接触卵母细胞的生理过程，必须

在精子穿透卵母细胞膜和与卵母细胞融合之前完成。钙内流被认为是正常

顶体反应的第一步。在畸形精子患者和少精子症患者中，其精液检杳结果

可能正常，但精子的顶体结构或对顶体反应刺激的反应性发生改变。可诱

导顶体反应的刺激物有多种。其中，卵透明带蛋白和黄体酮被认为是精子

顶体反应的生理诱导物。最近一项荟萃分析显示［57］,生理刺激诱导后

的精子顶体反应率与妊娠率存在重要关联。顶体反应诱导后的精子顶体状

态可借助具有荧光标识的凝集素或者针对顶体抗原CD46的单克隆抗体

［58,59］通过流式细胞术检测。包括顶体反应诱导物诱导的钙内流也是

检测获能精子进行顶体反应完整性的一种手段［60,61］0

1精子顶体状态评估:通常使用FITC标记的花生凝集素可以绑定精子顶体

外膜的特性评估活精子中的顶体反应［62］。使用荧光显微镜在1000倍

油镜下计数200个精子，将精子进行以下分类：顶体完整活精子、顶体反

应活精子。以最接近的整数报告顶体反应精子的百分比。

2.诱导顶体反应检杳：临床实验室通常采用钙离子载体A23187和孕酮诱

导顶体反应［63］。FITC-PSA进行染色，将精子分为：I型，顶体完整

活精子；口型，顶体帽部分脱落精子；HI型，顶体帽完全脱落精子；W型，

头部全部脱落精子。顶体反应率=（口型+HI型+IV型）精子/（I型+11型

+DI型+IV型）。

（三）精子染色质测定

精子染色质结构的稳定性对胚胎发育和质量至关重要，可能得益于父系基

因的保护作用和快速有效性［64］.精子染色质紊乱与辅助生殖的低受孕

率存在关联［65］。染色质结构异常可造成精子DNA破坏,如由于DNA

压缩错误导致双链或单链DNA的断裂。精子染色质正常与否可通过DNA

链断裂检测或可结合组蛋白的染料（苯胺蓝）或核酸染料（色霉素A3）

进行组织或流式检测。

1.苯胺蓝染色检测：苯胺蓝可结合组蛋白的赖氨酸残基。油镜视野下计数

至少200个精子，报告苯胺蓝阳性精子在全部精液或梯度稀释精子中的百

分率。

2.色素酶A3染色检测：色素酶A3可与鱼精蛋白竞争性结合DNA螺旋小

凹槽。在荧光显微镜油镜视野下计数至少200个精子，报告被色素酶A3

染色精子在全部精液或上游分层法分离的精子中的百分率。

（四）精子跨膜离子通量和转运功能分析

精子跨膜离子通量和转运功能分析可能是开发诊断工具的一种方法，能更

好地查明男性不育因素和男性生殖器官疾病。精子运动定向、获能、过度

活化和顶体外分泌受到pH变化、膜电压和胞内Ca2+的协同调控。这些

信号事件由独特的精子特异的离子通道、物质交换装置和转运蛋白，如对

酸度高度敏感的CatSper钙通道、Slo3钾离子通道、钙离子ATP酶和镁

离子通道来共同完成。许多不明原因的精子功能异常可能与一种或多种此

类蛋白的功能缺陷存在联系。一些支持性证据表明，基因畸变导致的

CatSper基因改变、CatSper蛋白功能或表达缺陷和钾通道功能缺陷与男

性不育症存在关联［66］。目前，可以评估患者精子离子通道、交换蛋白

和转运装置功能的常规检测依然缺乏。

1.精子CatSper通道功能的电生理学和动态钙离子荧光检测：精子特异黄

体酮活化的CatSper通道控制着进入鞭毛的钙离子内流，影响精子的泳动。

CatSper功能的缺失与男性不育和人工辅助生殖失败存在联系［67］,提

示CatSper功能不全的精子只能依靠卵子胞浆内单精子显微注射技术完

成受孕。人类精子CatSper功能可通过电生理学和动态钙离子荧光检测得

以完成。

2.精子K+通道功能的电生理学和荧光检测：人类精子K+通道功能，如

Slo3可分别通过膜片钳全细胞记录技术和膜电压荧光分析技术进行低、中

通量的研究。Slo3是精子中主要的K+,由Ca2+激活，以Ca2+依赖的

形式决定人类精子膜电位［］电生理全细胞记录技术，使用含二价离

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子的胞外溶液抑制CatSper电流，和K+为基础的排出液通过膜电压的去

极化诱发癫痫的Slo3电流。这种方法使得一些具有异常K+通道和去极化

膜电位的患者得以诊断，这些患者的人工辅助生殖受孕率也处在低水平。

精子K+通道活性检测的中通量手段依赖于对电压敏感的荧光标志物。此

类标志物反映膜电压变化及荧光发射变化，如膜电压依赖的胞外基质和胞

浆间的荧光分布改变。作为筛杳，选用纯化精子或稀释精液与标志物共孵

育数分钟。此后，利用荧光读数器或分光光度计分别读取微孔板或小池中

的荧光，或者在单细胞水平使用流式细胞术。用K+离子载体缴氨霉素和

不同K+浓度的溶液处理精子。缴氨霉素将膜电位设定为相应的K+能斯特

电位。因