第34章 DNA的复制和修复-课件

第34章DNA的复制和修复DNAReplicationandRepairDNAReplication第34章DNA的复制和修复-

DNA复制

DNA修复合成

反转录DNA的体外复制：分子克隆（PCR）。DNA生物合成第一节DNA的生物合成DNA生物合成的方式：第34章DNA的复制和修复-一、DNA复制的起点和复制方式复制子:基因组中可以独立进行复制的单位，它包括DNA每条链的一个复制起点序列和一些终止序列。1、原核生物为单复制子，真核生物为多复制子第34章DNA的复制和修复-2、复制往往具有一定的起点酵母：ARS（起点识别复合物ORC识别)originof

Chromosomalreplication

大肠杆菌：OriC（由DnaA蛋白识别）ThreetypesofDNAsequencesinoriCarefunctionallysignificantAT-richregionDnaAboxesGATCmethylationsites(autonomouslyreplicatingsequences)（originrecognitioncomplex）第34章DNA的复制和修复-大肠杆菌的复制起点：OriC第34章DNA的复制和修复-研究大肠杆菌DNA复制时发现，DNA复制的发动与DNA甲基化和细菌质膜有关。大肠杆菌复制起点叫oriC，由245bp构成，在oriC中有11个含4bp的回文序列“GATC”，Dam甲基化酶可使该序列中的腺嘌呤第6位N甲基化。

DNA的复制调控发生在起始阶段第34章DNA的复制和修复-

DNA的复制调控发生在起始阶段oriC

的11个回文序列

半甲基化DNA不启动复制，oriC与膜结合DNA全部复制完并延迟一定时间后，子链DNA被甲基化新一轮复制第34章DNA的复制和修复-DNA复制起点的特点（1）复制起点较保守富含AT，含一些反向重复序列（2）两条链复制起点可以在不同的点上（如：D-环复制）（3）复制起点的检测方法：分子杂交（4）DNA复制的控制在起点控制，复制的速度决定于起始频率（延伸的速度比较恒定，不决定于培养基状况）DNA链的呼吸作用：DNA（复制原点处）氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。第34章DNA的复制和修复-定位复制起点的方法首先将E.coli染色体，切成1%染色体长度的片段，分别进行（分子杂交），后放射自显影大肠杆菌OriC在liv位点P409第34章DNA的复制和修复-思考题从大肠杆菌中分离到一个质粒，如何确定该质粒复制起点找一个已知的质粒，用酶切将这个质粒的质粒复制起点切掉，回收其它部分。将要检测的质粒使用相应的方法，如PCR、酶切等，将这个质粒分解成小片段，与无复制起点的质粒进行连接转化，有克隆产生的大肠杆菌，这个质粒里就克隆有你要的质粒复制起点。第34章DNA的复制和修复-判断题1.通常DNA复制终止时并不需要特定的信号。(×)

中山大学2002年生物化学试题2.真核生物DNA复制起点的序列专一性要低于细菌和病毒（×）.思考题第34章DNA的复制和修复-1.一条染色体上具有多个复制子。2.同一染色体上，各复制子长度不同。3.不同生长期，复制子数目不同。如果蝇，生长旺盛期，细胞快速分裂，复制子数目可扩增十倍。4.每个复制起点在每个复制周期中只启动一次。5.相邻复制子的终点是随机碰撞会合的。真核生物复制子特点南京农业大学第34章DNA的复制和修复-

3.复制的类型和方式

复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。（1）、直线双向复制单点，T7多点，真核染色体DNA（2）、θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E.coli.）（3）、滚环复制（单向复制）：环状单链DNA，Φx174（4）、D环复制：线粒体、叶绿体DNA（不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制，（单向复制，全连续复制，没有冈崎片段）第34章DNA的复制和修复-复制的类型和方式第34章DNA的复制和修复-复制的方向判断先低放射性再高放射性第34章DNA的复制和修复-复制的类型和方式—D环复制•D-环扩充越过被取代链的复制起点；•

被取代链启动复制，方向与第一条链相反；•

两条链的合成没有冈崎片断单向复制，全连续复制第34章DNA的复制和修复-复制的类型和方式—滚环复制•主要发生在病毒中,细菌F因子(Ffactor)；如φX174噬菌体

•在正链DNA上打开一个切口；•以切口的3’-端为引物开始合成环链DNA的互补链，取代开环的链；3’-OH第34章DNA的复制和修复-复制的类型和方式—滚环复制NOTE:cangetsingleunitgenomesormultimericcopies单向复制？第34章DNA的复制和修复-复制的类型和方式—滚环复制E.coliphage(噬菌体）:ΦX174“Template“rolls”,extrudesleadingstrandOkazakifragsmadeonleadingstrandasitemerges.第34章DNA的复制和修复-复制的类型和方式—多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上取决于起始频率。

E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟[4.2X106/（50KbX2）=42]。富营养时，可采取多复制叉复制方式，结果20min可以复制一代。真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。第34章DNA的复制和修复-1.已知大肠杆菌在37摄氏度时双向复制一次约需40分钟，但在这些培养基内，细菌分裂可达20分钟一次，为什么？

中山大学2000年生物化学试题思考题第34章DNA的复制和修复-二、DNA复制的两个特点（一）.DNA半保留复制

1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。

1、半保留复制(semiconservativereplication)：

定义：DNA复制的一种方式，每条链都可用作合成互补链的模板，合成出两分子的双链DNA，每个分子都是由一条亲代链和一条新合成的链组成。

意义：按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。是物种稳定的分子基础，但是相对的。第34章DNA的复制和修复-弥散式possiblecopyingmechanismOFDNADNA复制方式有三种可能性，即全保留、半保留和分散式。第34章DNA的复制和修复-

2.

DNA半保留复制的证明(两个)(1)

密度梯度离心(重同位素标记）1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA标记，同时可以否定另外两种复制方式第34章DNA的复制和修复-密度梯度离心第34章DNA的复制和修复-(2)

放射性同位素自显影•

1963年，Cairns设计了一个更为严谨的实验—放射自显影的方法，进一步证实了DNA的半保留复制；•

1957年，Taylor的实验证明，在真核生物中，DNA的复制也是半保留的 B:（双链标记）A和C:（单链标记）H3-标记的脱氧胸苷第34章DNA的复制和修复-•

单链DNA首先复制合成双链的复制型（单链DNA复制时，通常先宣传双链复制型，再进行半保留复制）半保留复制非常普遍第34章DNA的复制和修复-1.设计实验证明DNA是半保留复制

-2012大连理工大学生物化学2.猪流感病毒HRN1是反转录病毒，试想出实验方案以阻止病毒在细胞内复制而不影响细胞内DNA正常复制。一个同学想研究DNA复制过程用放射性磷来标记底物，他标记的磷是第三位的磷，问是否能够达到目的？-2012山东大学生物化学

3.简述MettewMeselson和FranklinStahl设计了一个什么样的实验,证实DNA的复制是半保留复制思考题华东师范大学2007年生物化学第34章DNA的复制和修复-（二）、半不连续复制（P418）

定义：DNA聚合酶只能按5‘—3’方向催化合成DNA不能催化3‘—5’方向合成,这样一条链连续合成和另一条链不连续合成的复制方式,称为DNA的半不连续复制.领头链随从链冈崎片段:引物第34章DNA的复制和修复-半不连续复制(续1)

领头链:对应3’—5‘的模板链，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。

随从链:对应5‘—3’的模板链，复制的方向与解链方向相反，复制不是连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。冈崎片段:随从链中不连续的DNA片段称为冈崎片段。

原核生物:1000~2000个核苷酸真核生物:100~200个核苷酸（相当一个核小体）第34章DNA的复制和修复-前导链和滞后链的相对性冈崎片段不是一个复制子，其起点也非复制起点前导链和滞后链是针对某个复制叉而言的5`-5`-3`-3`-5`-3`-5`-3`-第34章DNA的复制和修复-思考题1.

是非判断题

DNA分子是由两条链组成，其中一条链作为前导链的模板，另一条链作为后随链的模板。

厦门大学2005年生物化学第34章DNA的复制和修复-思考题（1）如何证明冈崎片断的存在？（2）最初对冈崎片断测定的实验表明，其数量远超过新合成

DNA的一半，好象两条脸都是不连续的，试分析原因？提示：（1）同位素标记dNTP，经过一段时间后终止合成，检查发现标记出现在小片段DNA上，且小片段DNA分子量相同，数量较多。

（2）前导链会少量的UMP掺入，后尿嘧啶碱基被切除形成AP位点，后该处磷酸二酯键打断，部分核苷酸，水解，造成一个缺口，后被修复，该过程会产生一些类似冈崎片断的DNA片段。第34章DNA的复制和修复-脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成：dUTP一旦形成就被转化成dUMP

?第34章DNA的复制和修复-碱基切除修复N-糖苷酶核酸内切酶DNA聚合酶1N-糖苷酶又称为DNA糖基化酶解释第34章DNA的复制和修复-解释UUdenature

糖苷酶-

ung–

dump片段越长,大约有一半的新生DNA为被脉冲标记的冈奇片段

dut

–

dump片段越短AAdUTPase

DNA没有U！第34章DNA的复制和修复-解释E.colidUTPase，它能使

dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。第34章DNA的复制和修复-解释(1)在dut-突变体（

dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut+中为短。这是因为U掺入机会增加；(2)在

ung-

（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。(3)

因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。在dut-,ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。第34章DNA的复制和修复-思考题1.细胞DNA复制是半不连续的，这是因为：

A.DNA聚合酶只能从3→5合成DNA链

B.模板双链是反平行的

C.DNA聚合酶只能一个一个地加接核苷酸残基

D.DNA酶法合成是个自发过程

南开大学2006年生物化学2.论述半保留复制和半不连续复制的过程

2011年天津大学生物化学第34章DNA的复制和修复-思考题3.

DNA是以半保留方式进行复制的，如果放射性全标记的双链DNA分子在无放射性标记的溶液中经两次复制，那么所产生的4个DNA分子其放射性状况如何？A、两个分子含有放射性；

B、全部含有放射性；C、双链中各有一半含有放射性；D、所有分子的两条链都没有放射性。

华南理工大学2006年生物化学第34章DNA的复制和修复-三、

DNA复制有关的酶及蛋白质因子底物：dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP）模板（template）：解开成单链的DNA母链引物（primer）：提供3`-OH末端(体内为RNA,体外为DNA,如PCR反应)酶及蛋白质因子DNA聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶解链（解旋酶）类，单链结合蛋白引物酶与dnaB蛋白，拓扑异构酶

DNA连接酶（P410）第34章DNA的复制和修复-ā1、DNA聚合酶反应的特点

需DNA模板

需引物

(DNA、RNA)

需4种dNTP

5`→3`方向越长（化学合成方向相反）

（一）

DNA的聚合反应和DNA聚合酶αDNA+dNTP=DNA(n+1)+PPi第34章DNA的复制和修复-思考题1.一个同学想研究DNA复制过程用放射性磷来标记底物，他标记的磷是第3位的磷，问是否能够达到目的。

2012年山东大学生物化学第34章DNA的复制和修复-53复制方向的证明

3`→5`复制：形成5`→3`磷酸二酯键5`→3`复制：形成3`→5`磷酸二酯键链终止法测序？第34章DNA的复制和修复-5

3复制方向的证明3`3’→5‘磷酸二酯键5‘→3’磷酸二酯键3`第34章DNA的复制和修复-53复制方向的证明

3`→5`复制：形成5`→3`磷酸二酯键5`→3`复制：形成3`→5`磷酸二酯键ddNTP可以掺入合成的链，造成链的终止ddNTP不能够掺入合成的链，不造成链的终止第34章DNA的复制和修复-复制的方向新合成的DNA链延长的方向5‘

3'证明:利用ddNTP，体外进行DNA合成，合成体系中加入ddNTP，如果造成链的终止，则合成方向为5‘3’,如果没有造成链的终止，则合成方向为3’5‘，因为这是形成的键为5‘3’磷酸二酯键，由于ddNTP没有3’-OH所以不能掺入DNA中，也就不会造成链的终止。第34章DNA的复制和修复-5`3`复制方向的原因ThisDoesn’tWork!ThisDoesWork!原因：(1).核苷酸均为5`核苷酸(2).错误碱基采取水解去除的方式第34章DNA的复制和修复-53复制方向的原因NTPsNucleotideTriPosphare3‘5’5`3`3`5`第34章DNA的复制和修复-

2.

大肠杆菌的DNA聚合酶DNA聚合酶：

DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA-polⅣDNA-polⅤ依赖DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均缩写为DDDP。第34章DNA的复制和修复-

（1）.大肠杆菌的DNA聚合酶I单链球状蛋白，含锌原子，多功能酶。①DNA聚合酶活力（使DNA链从5→3方向延长）②3→5核酸外切酶活力，起校正功能；③5→3核酸外切酶活力，切除引物或修复由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体；④聚合反应的逆反应（由3端焦磷酸解）第34章DNA的复制和修复-DNA聚合酶I的功能遗传学分析表明DNA聚合酶I复制速度慢，持续合成能力差，不是主要的复制酶，主要是参与引物切成或DNA的损伤修复DNA-polⅠ木瓜蛋白酶N端C端小片段大片段/Klenow片段53核酸外切酶活性DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性第34章DNA的复制和修复-DNA聚合酶

I的特点

Klenow片段(Klenowfragment)：E.coliDNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5`-3`聚合酶和3`-5`外切酶活性，

Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

Sanger法（双脱氧非）DNA测序中使用Klenow片段优于全酶？最好使用没有校对活性的酶？第34章DNA的复制和修复-DNA的链终止法测序测序酶没有外切酶活性第34章DNA的复制和修复-DNA聚合酶I的特点

DNA复制过程中碱基对受双重校对：（DNA聚合酶选择作用）和（3`→5`外切酶的校对作用）第34章DNA的复制和修复-思考题1．DNA切口平移所用的酶为（）。A、Klenow酶

B、Taq酶C、DNA聚合酶ID、DNA连接酶第34章DNA的复制和修复-（2）.大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅱ

5′→3’聚合酶活性

3’→5′外切酶活性

无5’→3’外切酶活性它只是在无polI及polⅢ的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在损伤修复中有特殊作用。在DNA聚合酶

I活性低的细菌中发现第34章DNA的复制和修复-

(3).大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅲ①结构特点：含锌原子

由10种亚基组成不对称异源二聚体。核心酶（αεθ）

α亚基：5′→3′聚合酶活性

ε亚基：3′→5′外切酶活性和碱基选择功能，是复制保真性所必需

θ亚基:可能起组装作用β亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动,维持进行性γ-复合物：促进全酶组装至模板及增强核心酶活性EpsilonTheta第34章DNA的复制和修复-DNA聚合酶Ⅲ全酶功能：原核生物复制延长中真正起催化作用的酶第34章DNA的复制和修复-大肠杆菌的三种DNA聚合酶小节催化DNA聚合，主要复制酶参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数--+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性polIIIpolIIpolI突变后的致死性

可能？可能第34章DNA的复制和修复-（4）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ.新近发现的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ，参与易错链的修复。polIV:(encodedbydinBgene)

a)SOSrepairenzymeofdamagedDNApolV:(encodedbyumuD’2Cgene)a)SOSrepairenzymeofdamagedDNA第34章DNA的复制和修复-3.

DNA连接酶（DNAligase）

连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要提供能量细菌的连接酶利用NAD+。动物和噬菌体的连接酶利用ATP

只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存在的DNA或RNA单链。若DNA两股都有单链缺口，只要缺口前后碱基互补也可连接

DNA连接酶在复制、DNA修复、重组、剪接中均起缝合缺口作用。是重要的工具酶之一。P417第34章DNA的复制和修复-ThereactioncatalyzedbyDNAligase酶ATP(或NAD+)+酶酶ConnecttwoadjacentssDNAstrandsbyjoiningthe3´-OHofoneDNAstrandtothe5´-PofanotherDNAstrand.第34章DNA的复制和修复-ThereactioncatalyzedbyDNAligase(1)NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5'-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;(3)被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。第34章DNA的复制和修复-4.

引物酶(primerase)（P419）引物引物引物酶第一个核苷酸往往为A或G第34章DNA的复制和修复-引物酶(primerase)冈崎片断的合成除需要dNTP外，还需要(NTP)-引物需要•

冈崎片断的5’末端连接有小段RNA做引物∴DNA复制需RNA聚合酶-（引物合成酶）(primase)•

引物合成酶为dna

G基因编码，单亚基；•对RNA聚合酶抑制剂不敏感，对利福平不敏感•引物酶,本身无活性,需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。大肠杆菌的引物酶：DnaG

合成引物50-100nt（长）真核生物的引物酶：DNA聚合酶a

合成引物10nt左右P419第34章DNA的复制和修复-引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合（DDRP）该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3’-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

DNA复制为什么要用引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？为什么引物为RNA?）

⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配

⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的3，→5，校对功能难发挥作用。

前导链只需要一个引物，滞后链需要多个引物引物酶(primerase)第34章DNA的复制和修复-5.DNA复制的拓扑异构性质UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion

天然DNA存在着负超螺旋，这对于DNA分子的解旋非常由利。但随着复制的进行，复制叉前方的亲代DNA重仍然会积累巨大的张力，现在发现这种张力主要是通过DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）作用消除的。P419第34章DNA的复制和修复-DNA复制的拓扑异构性质拓扑异构酶Ⅰ:(与转录有关)切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。每一次催化作用可消除一个负超螺旋，L值增加1.反应不需ATP拓扑异构酶Ⅱ:(与复制有关)切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子引入负超螺旋状态。每次催化作用使L减少2，又称促旋酶。

细菌中称为旋转酶属于拓扑异构酶Ⅱ第34章DNA的复制和修复-TypeItopoisomerases第34章DNA的复制和修复-TypeItopoisomerases共价催化第34章DNA的复制和修复-ModelforTopoIIMechanismDNA分子引入负超螺旋状态Gyrase--ATypeIITopoisomerase第34章DNA的复制和修复-Topoisomerasesasdrugtargets:

BecausedividingcellsrequiregreatertopoisomeraseactivityduetoincreasedDNAsynthesis,topoisomeraseinhibitorsareusedaschemotherapeuticagents.Camptothecin(喜树碱)--TopoIinhibitorDoxorubicin(阿霉素或多柔比星)--TopoIIinhibitor

ThesedrugsactbystablilzingtheDNA-Topoisomerasecomplex.Also,someantibioticsareinhibitorsofthebacterial-specifictoposisomeraseDNAgyrasee.g.ciprofloxacin喹诺酮类

杀菌与抗癌第34章DNA的复制和修复-6.

DNA解螺旋酶（解旋酶）•

解链酶依赖于单链DNA，对单链DNA亲和力强•解旋过程消耗ATP：2ATP/bp；具有ATPase活性

DnaB

蛋白在后随链模板沿5’→3’移动；•

Rep蛋白或PriA

蛋白沿前导链模板3’→5’移动

DNA解螺旋酶（解旋酶）不是拓扑异构酶，细菌中拓扑异构酶称为旋转酶P421第34章DNA的复制和修复-7.单链DNA结合蛋白四聚体的蛋白；与DNA单链发生结合；结合具有协同效应稳定DNA解链后的单链状态，并保护核酸不被降解。使DNA的Tm下降真核生物中为Rp-A缺失会致死

SingleStrandDNABandingProtein(SSB)P421第34章DNA的复制和修复-原核生物DNA复制起始的相关蛋白质

四、原核生物DNA复制的过程复制起始，延伸，终止三个基本步骤蛋白功能曾用名DnaA辨认复制起点

DnaB结合于DnaA,提供解旋酶活性解螺旋酶DnaC与DnaB形成复合体

DnaG合成引物

引物酶

HU刺激起始，促进复合体形成

Gyrase解除正超螺旋，引入负超螺旋

旋转酶

SSB稳定单链DNA单链结合蛋白第34章DNA的复制和修复-(一).

DNA复制的起始(initiation)第34章DNA的复制和修复-E.coli复制起始点—oriC的序列特征

E.coli的复制起点OriC是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。有二个必需区域：4个是9bp重复序列，能与起始蛋白DnaA特异结合，对于DNA复制的起始十分重要；3个是个连续出现的13bp序列，富含A和T，有利于双螺旋DNA局部解旋并暴露两条复制模板链。富含A和T第34章DNA的复制和修复-DNA复制的起始DnaBDnaGDnaC引发体(DnaB+DnaG)+ATPHU第34章DNA的复制和修复-DNA复制的起始复制起始消耗ATP第34章DNA的复制和修复-引发体(primosome)与引物合成

DnaB有两个功能,其一是解螺旋酶;另一是活化引物合成酶（DnaG）,与DnaG引物合成酶构成复制体的一个基本功能单位,称为引发体（DnaB+DnaG），合成引物在某些噬菌体DNA的复制过程中,引发体还包括一些辅助蛋白,称为前引发蛋白,DnaB,DnaC,DnaT,PriA,PriB,

.φX174DNA第34章DNA的复制和修复-引物

前导链合成一个引物,滞后链则结合多个引物酶,合成许多冈崎片段的引物。在同一复制叉上，引物的合成前导链早于滞后链。•

是短链RNA。（体外为PCR中DNA)•

长度一般：原核生物,10-60bp（长）真核生物,2-10bp(哺乳动物)

前导链引物长于滞后链冈崎片段引物•合成方向是5'→3'方向。•提供的3‘-OH，可在DNA-polⅢ催化下，利用dNTP

生成磷酸二酯键。第34章DNA的复制和修复-引发体沿着模板链5’→3’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成复制叉复制时，双链DNA由起始点处打开，沿两条张开的单链模板合成DNA新链，两侧形成的Y结构称为复制叉(replicationfork)。在DNA聚合酶Ⅲ作用下，在新链第一个脱氧核苷酸加到引物3`-OH末端后，复制开始第34章DNA的复制和修复-

DNA的复制调控发生在起始阶段oriC

的11个回文序列半甲基化DNA不启动复制，oriC与膜结合DNA全部复制完并延迟一定时间后，子链DNA被甲基化新一轮复制第34章DNA的复制和修复-

2.复制的延伸原核DNA聚合酶III以二聚体形式在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。

前导链(leadingstrand):以一条链(3′5′)为模板时,子代链的合成方向是5′3′,由引物酶在原点合成一条短RNA链，DNA多聚酶III结合于引物并加接脱氧核糖核苷酸残基一旦合成开始,前导链的合成便连续地进行,紧跟着复制叉移动.合成是连续的.

随后链(laggingstrand):

以另一条亲代链(5′3′)为模板时,子代链的合成方向5′3′滞后链的合成是不连续的以短的冈崎片断的形式完成的,每合成一个冈崎片段都需起始一次,由引物酶合成一个引物.

第34章DNA的复制和修复-

复制的延伸(elongation)第34章DNA的复制和修复-DNA复制的过程-随后链

RNA引物的水解:在DNA聚合酶Ⅰ的催化下,水解除去RNA引物,同时催化DNA片段继续延长至另一DNA片段的5'端.在DNA聚合酶和连接酶的催化下，DNA片段沿5’→3’合成DNA填补并连接成完整的DNA分子。

DNApolIDNApolIIIDNAligase第34章DNA的复制和修复-细菌领头链和随从链的延长差异

前导链滞后链前体dNTP:dATP,

dGTP,

dCTP,dTTPdNTP:dATP,dGTP,dCTP,dTTPNTP:ATP,GTP,CTP,UTP酶DNA旋转酶，解螺旋酶，单链DNA结合蛋白（SSB），DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶DNA旋转酶，解螺旋酶，单链DNA结合蛋白（SSB），DNA聚合酶Ⅲ，焦磷酸酶，引物酶，DNA聚合酶Ⅰ，DNA连接酶和NAD+复制延伸过程中的各种原料、酶或蛋白质因子第34章DNA的复制和修复-切口平移NickTranslationRequires5’-3’activityofDNApolIStepsAtanick(free3’OH)intheDNAtheDNApolIbindsanddigestsnucleotidesina5’-3’directionTheDNApolymeraseactivitysynthesizesanewDNAstrandAnickremainsastheDNApolIdissociatesfromthedsDNA.ThenickisclosedviaDNAligase第34章DNA的复制和修复-后随链的模板在全酶上绕转180.形成一个小环第34章DNA的复制和修复-)复制体(replisome)复制体：是在复制叉附近与DNA复制有关的酶和蛋白质因子，他们在复制叉上形成离散的复合物,彼此配合,进行高度精确的复制,这种结构称为复制体(DNApolⅢ二聚体、引发体和DnaB等)复制体的基本活动包括：1）双链的解开；2）RNA引物的合成；3）DNA链的延长；4）切除RNA引物，填补缺口，连接DNA片段；5）切除和修复错配碱基。第34章DNA的复制和修复-3.E.coliDNA合成的终止现已发现有两个终止区域

（terE,D,A

和terC,B,F），位于相遇点的另一侧100Kb

处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。终止需要Tus(36kD)，

Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。

ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止(termination)第34章DNA的复制和修复-E.coliDNA合成的终止

ThetwonewlysynthesizedcircularchromosomalDNAs

aretopologicallyinterlinked(catenated)andisfinally

separatedbythe

actionofaTypeIItopoisomerases.

最后还有50-100bp通过修复方式填补拓扑异构酶Ⅳ第34章DNA的复制和修复-思考题1.在DNA复制过程中，两条新链的合成为何一条链是连续复制，另一条链是间断复制？并比较两条新链合成过程的不同点。

天津医科大学2006生物化学2.简述参与DNA复制的酶及基本过程复旦大学2003年考研生物化学3.细胞DNA复制是半不连续的，这是因为：

ADNA聚合酶只能从3→5合成DNA链B.模版双链是反平行的CDNA聚合酶只能一个一个地加接核苷酸残基DDNA酶法合成是个自发过程南开大学2006年生物化学考研试题第34章DNA的复制和修复-思考题4.以下哪个过程不需要DNA连接酶?

(A)DNA复制(B)DNA修复(C)DNA重组

(D)制备重组DNA

(E)DNA断裂和修饰。5需要以RNA为引物的是:

(A)DNA复制(B)RNA转录(C)转录

(D)蛋自质合成(E)RNA复制

华东师范大学2006生物化学考研6.叙述DNA聚合酶I在大肠杆菌细胞DNA复制中的功能，并介绍这个酶在生物技术中的应用。（10分）

南开大学2006年生物化学7.原核生物DNA复制的过程

中国农业大学2011年生物化学第34章DNA的复制和修复-思考题8.

关于DNA复制的叙述()

A．有DNA指导的RNA聚酶参加，B．有RNA指导的DNA聚合酶参加，C.为半保留复制D.有DNA指导的DNA聚合酶参加

山东大学2001生物化学9.在一个复制叉之中，以下哪一种蛋白质的数量最多?

（A）DNA聚合酶（B）引发酶（C）SSB

（D）DNA解链酶（E）DNA拓扑异构酶

华东师范大学2007年第34章DNA的复制和修复-五真核生物DNA复制（1）.Semi-conservativereplication（2）.Semi-discontinuousrepliction（3）.DNAhelicase（4）.RNApriming(5).

校对（Proofreading）(6).

单链结合蛋白真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的相同点第34章DNA的复制和修复-真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的差异1.真核生物复制慢：原核细胞DNA复制叉移动速度快，细菌复制叉移动速度为50000bp/min，哺乳动物DNA复制叉移动速度慢,约为1000~3000bp/min。2.真核细胞含多个复制子，多个复制起点。人平均每个染色体上有1000个复制子，原核细胞DNA中多数只有一个复制子。3.真核细胞的复制子在每个细胞周期仅复制一次，原核细胞在快速生长时，在DNA复制起点可连续复制多次，4.引物和冈崎片段较短5.连接酶需ATP

6.

端粒的复制7.聚合酶和蛋白质因子不同。真核细胞DNA与组蛋白结合成核小体，原核细胞DNA不存在核小体。第34章DNA的复制和修复-真核生物的五种DNA聚合酶(1)DNA-pol

（核内）:起始引发，有引物酶活性。

（DNA-polα+primase形成紧密的复合物）(2)DNA-pol

（核内）:参与低保真度的复制。(3)DNA-pol

（德尔塔）（核内）:延长子链的主要酶，有持续合成DNA链的活性又有校读功能,和组织相容抗原

PCNA)相互作用。(4)DNA-pol

（伊普西龙）（核内）:修复损伤DNA

和填补引物空隙的功能。(5)DNA-pol

（线粒体内）:在线粒体DNA复制中起作用。第34章DNA的复制和修复-真核生物的五种DNA聚合酶DNA-polⅢDNA-polⅠ原核生物DnaG,primase德尔塔伊普西龙第34章DNA的复制和修复-DNA复制的起始起始DNA第34章DNA的复制和修复-后随链的模板在全酶上绕转180.形成一个小环FIGURE:ThreedifferentDNApolymerasesmakeuptheeukaryoticreplicationforkpol

（德尔塔）pol

（伊普西龙）1、真核生物的复制由Pol

（形成引物-RNA和DNA）和Pol

或pol

共同完成2、两个

Pol

或一个

Pol

与一个pol

在引物后延长DNA第34章DNA的复制和修复-真核生物引物的切除FEN1又写为MF-1

DNA-pol

（伊普西龙）第34章DNA的复制和修复-真核生物DNA复制的过程1、DNAPol

形成引物（RNA和DNA）2、两个DNAPol

（德尔塔）或一个DNAPol

与一个DNA-pol

（伊普西龙）在引物后延长DNA3、RNaseH1和FEN1(MF-1)蛋白切除冈崎片段RNA引物的4.

DNA聚合酶ε填补缺口，类似细菌-DNA-polⅠ5.

DNA连接酶进行连接反应。DNA-pol

（德尔塔）（核内）:延长子链的主要酶起作用。第34章DNA的复制和修复-真核和原核细胞的DNA复制比较

功能E.coli人复制酶PolⅢ的全酶Polα/Polδ进行性因子

夹子PCNA定位因子复合体RF-CSSB引物酶DnaGPolα-引发酶去除引物的酶

DNA聚合酶1

RNaseH1和MF-1后随连修复酶DNA聚合酶1和DNA聚合酶εDNA连接酶DNA连接酶1解旋酶DnaBT抗原消除拓扑张力酶旋转酶拓扑异构酶单链结合蛋白SSBRP-A起始蛋白DnaAT抗原

注：MF-1又写为FEN1P426第34章DNA的复制和修复-真核和原核细胞的DNA复制比较第34章DNA的复制和修复-真核细胞的DNA复制的相关蛋白质第34章DNA的复制和修复-环状DNA

大肠杆菌能否完整复制真核生物链状染色体？线状DNA:滞后链复制不完整

DNA复制的末端第34章DNA的复制和修复-由RNA（做模版）和蛋白质（逆转录酶）构成的一种核糖核蛋白复合体，维持端粒的长度。端粒酶(telomerase):是一种反转录酶,修补端粒序列端粒酶第34章DNA的复制和修复-端粒酶人类端粒酶含三部分：

端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白、端粒酶逆转录酶，除骨髓干细胞、胚胎原始干细胞等细胞外,大多数正常人体细胞检测不到端粒酶活性。恶性肿瘤细胞中,85%～90%端粒酶强阳性。端粒酶可作为肿瘤标志和肿瘤治疗靶点.原核生物没有端粒酶

端粒由成百个6个核苷酸的重复序列所组成（人为TTAGGG，四膜虫为TTGGGG）。端粒也被科学家称作“生命时钟”。第34章DNA的复制和修复-Telomereshortening端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐变短至消失，可导致染色体稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。体细胞几乎没有端粒酶活性，随多次细胞分裂端粒逐渐缩短，细胞失去增殖能力。而端粒酶活性较高的胚原细胞，端粒长度未缩短肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒结构致使染色体稳定而成为永生细胞。端粒与早衰TelomeraseisOnlyActiveInCertainCells第34章DNA的复制和修复-设计肿瘤治疗靶点.

1.核糖核苷酸合成2.核糖核苷酸还原成脱氧核糖核苷酸3.拓扑异构酶4.端粒酶

第34章DNA的复制和修复-三位美国科学家伊丽莎白•布兰克波恩、卡罗尔•格雷德以及杰克•绍斯塔克共同获得该奖项。他们发现了由染色体根冠制造的端粒酶(telomerase)，这种染色体的自然脱落物将引发衰老和癌症。2009诺贝尔生理学或医学奖第34章DNA的复制和修复-六、

DNA复制的忠实性机制

DNA复制的差错率只有10-8－10-101.

DNA聚合酶的选择作用（根据碱基配对规律，但碱基有烯醇式和酮式两种构象）2.DNA聚合酶本身具有校正功能（3'→5'外切酶活性）

加入错配碱基后合成速率下降，为校对修复留出时间：动力学校对3.

细胞内有错配修复等损伤修复系统4.

细胞维持dNTP的平衡水平；5.

RNA作为合成引物（起始合成时易出错）；前导链和滞后链的忠实性程度往往不同DNA复制时，新链合成都遵循碱基配对原则！第34章DNA的复制和修复-1.哪些机制保证了DNA复制的准确性？为什么生物体内转录的准确性没有DNA复制准确性高？10分

中国农业大学2012年生物化学思考题第34章DNA的复制和修复-第二节DNA的损伤和修复DNA损伤(DNAdamage)：是指遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。DNA的自发性损伤碱基错配：碱基异构、脱氨基和修饰物理因素引发的损伤紫外线电离辐射化学因素引发的损伤碱基烷基化、碱基脱落等碱基类似物第34章DNA的复制和修复-DNA修复系统功能错配修复修复错配DNA直接修复

修复嘧啶二体或甲基化DNA切除修复(碱基、核苷酸切除修复)切除突变的碱基和核苷酸片段重组修复复制后的修复SOS反应诱导的修复(细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制时，细胞为求生存而产生的一种应急措施)诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等，导致变异

DNA的损伤及修复第34章DNA的复制和修复-

DNA的损伤及修复修复形式

特点直接修复

DNA聚合酶不切除错配修复修复复制错配碱基DNA聚合酶Ⅲ可达1000nt碱基切除修复修复碱基损伤DNA聚合酶1先去除碱基，再切几个nt核苷酸切除修复修复较大的损伤DNA聚合酶1如，切除13或29ntSOS反应很大的损伤DNA聚合酶(Ⅳ/Ⅴ

)第34章DNA的复制和修复-

DNA的损伤及修复

修复形式

用到的酶错配修复Dam甲基转移酶、DNA解螺旋酶、SSB、DNA聚合酶Ⅲ、DNA连接酶碱基切除修复DNA糖基化酶、AP核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶1、核苷酸切除修复UvABC核酸切除酶、DNA聚合酶1、DNA连接酶UvABC核酸切除酶好像识别螺旋扭曲，而不是特别基因，如识别TT嘧啶二聚体第34章DNA的复制和修复-

DNA的损伤及修复(一）错配修复(修复复制错误)

1、定义：在含有错配碱基对的分子中使正常的核苷酸序列恢复的修复方式。

2、参与错配修复的酶与蛋白质：

Dam甲基化酶;

MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶;

SSB;DNA聚合酶Ⅲ;DNA连接酶；第34章DNA的复制和修复-3.

大肠杆菌的错配修复过程识别新生链中非m6A

的GATC序列第34章DNA的复制和修复-大肠杆菌的错配修复第34章DNA的复制和修复-新旧DNA链的辨别新合成的子代链未甲基化几分钟后，新合成的子代链甲基化识别新生链中非m6A的GATC序列大肠杆菌的复制起始的调控？第34章DNA的复制和修复-(二)DNA的直接修复

DNA直接修复:修复过程不要切除碱基或核苷酸1

光复活:可见光(最有效波长400nm)激活生物界广泛分布(高等哺乳动物,如人类，除外)的光复活酶,该酶分解嘧啶二聚体.是一种高度专一的修复形式,只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体.2

O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶:将DNA上的被修饰的甲基(鸟嘌呤O6位上的甲基)移到蛋白质的半胱氨酸残基上。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活,防止G-T对形成。第34章DNA的复制和修复-1

光复活

1949年已发现细菌光复活现象，可见光可激活光复活酶，此酶专一分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。从单细胞生物到鸟类均有，高等哺乳动物没有此酶。而是将嘧啶二聚体切除修复。

为什么细菌在紫外光照射后在可见光下比暗处更容易存活？第34章DNA的复制和修复-2

O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶

Removesthemethylgroup.Themethylgroupistransferredtotheproteinitself,inactivatingtheprotein.第34章DNA的复制和修复-O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶第34章DNA的复制和修复-1、概念：在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。结构缺陷的修复：（1）核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。（2）核酸外切酶切除损伤的DNA。（3）DNA聚合酶1修复。（4）DNA连接酶连接。2、类型：（三）、切除修复（核苷酸）切除修复（碱基）切除修复第34章DNA的复制和修复-切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复

单个碱基缺陷的修复，如被碱基修饰，如烷基化DNA聚合酶1第34章DNA的复制和修复-碱基切除修复：指先切除受损失的碱基，形成AP位点（无嘌呤，无嘧啶位点），再在AP位点附近切除小段DNA片段，通过DNA聚合酶修复。损伤形式：如（1）碱基烷基化，（2）DNA复制时，有少量dUTP掺入DNA链等个别碱基的损伤。相关的酶：DNA糖基化酶（切除糖苷键，N-糖苷酶）具有专一性；

AP核酸内切酶；

DNA聚合酶1（兼有外切酶和聚合酶活性）碱基切除修复第34章DNA的复制和修复-碱基切除修复：不是直接替换碱基单个碱基缺陷的修复N-糖苷酶核酸内切酶DNA聚合酶1N-糖苷酶又称为DNA糖基化酶第34章DNA的复制和修复-核苷酸切除修复如果DNA损伤造成DNA螺旋结构较大变形，则需要以核苷酸切除修复，如环丁烷嘧啶二聚体和其他光反应产物以及一些化学物质产生的大加合物。核苷酸切除修复缺陷与癌症的发生有关，如着色性皮肤病，就是由于体内核苷酸切除修复系统缺陷引起，因缺乏能切除T-T二聚体的特异性核酸内切酶所致。

(1)如何证明人类T-T二聚体采取切除修复而不是细菌的直接修复？（H3标记的dTTP）-南京大学2002。

(2)

单个核苷酸插入或缺失造成的突变多用错配修复，不是核苷酸切除修复第34章DNA的复制和修复-TT嘧啶二聚体

TT嘧啶二聚体大肠杆菌光复活核苷酸切除修复高等哺乳动物核苷酸切除修复O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶大肠杆菌直接修复高等哺乳动物思考：着色性皮肤病和正常人的细胞经紫外线照射后，分裂DNA，并使之变性，发现正常人的单链DNA相对分子量明显减小，着色性皮肤病没有明显变化。为什么？着色性皮肤病：体内核苷酸切除修复系统缺陷引起第34章DNA的复制和修复-

核苷酸切除修复这种方式可以修复DNA发生的几乎所有类型的巨大损伤，包括某些与致癌剂共价结合的碱基第34章DNA的复制和修复-

（四）重组修复1、重组修复的定义受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。a、DNA重组活性（交换DNA链）b、与单链DNA结合活性c、少数蛋白的proteinase活性RecA的三种功能第34章DNA的复制和修复-重组修复过程SometimesDNAdamagepersistsratherthanbeingreversedorremoved,butitsharmfuleffectsmaybeminimized.Thisoftenrequiresreplicationacrossdamagedareas,sotheprocessiscalledpostreplicationrepairPostreplicationrepair第34章DNA的复制和修复-（五）、SOS反应及其诱导的修复

SOS诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复反应。广泛存在于真核和原核生物。现象：用紫外线照射过的λ噬菌体感染事先经低剂量紫外线照射的大肠杆菌，存活的噬菌体数大大增加，而且存活的噬菌体中出现较多的突变体。如果感染的是未经照射的大肠杆菌，那么噬菌体的存活率和突变率都较低。第34章DNA的复制和修复-

SOS反应及其诱导的修复

SOS反应诱导的修复系统包括：避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。倾向差错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶(Ⅳ/Ⅴ)，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向差错的修复。第34章DNA的复制和修复-

SOS反应及其诱导的修复SOS反应的机理：由

RecA

蛋白和LexA

阻遏物的相互作用引起的。

RecA蛋白：不仅在DNA的同源重组中起作用，也是SOS反应的最初的发动因子。在（单链DNA）和ATP存在时，RecA蛋白被激活。

LexA阻遏物：是许多基因的阻遏物，因其存在导致许多基因不表达。。诱导信号（单链DNA和ATP在体外）RecA蛋白，

LexA自身潜在的蛋白酶活性被激活

LexA自切割，消除LexA对RecA和SOS的阻遏激活激活

第34章DNA的复制和修复-

SOSandRepair当DNA复制受阻/DNAdamaged细胞内原少量表达的RecA-p与单链DNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA降解（自我分解）相关基因表达

SOSopen当DNA复制度过难关后RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff？第34章DNA的复制和修复-思考题1.大肠杆菌碱基错配修复系统所识别的核酸序列为()，被甲基化的碱基是()。

RecA蛋白与()结合后获得蛋白水解酶的活性。端粒酶由蛋白质和()两部分组成。

南开大学2000年生物化学2.E.coil参与错配修复的DNA聚合酶是_____。

华东师范大学2007年3.（判断）错配修复和重组修复因为发生在DNA复制之后，因此称为复制后修复。

中科院20064.对损伤的DNA进行光复活修复时，主要作用的部位是：