高效液相色谱法()

高效液相色谱法()HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段

柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测2．HPLC：分离和分析

柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测第2页,共83页，2024年2月25日，星期天HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%

HPLC:溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%第3页,共83页，2024年2月25日，星期天续前2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第4页,共83页，2024年2月25日，星期天HPLC的特点1高效能；高速度；高灵敏度；

2高度自动化

3流动相可选择性范围宽

4适用范围广：样品不受挥发性及热稳定性的限制，只要求样品能制成液体。

5流出组分易收集。第5页,共83页，2024年2月25日，星期天HPLC的类型分配色谱吸附色谱，又称液固色谱离子交换色谱尺寸排斥色谱，又称凝胶色谱第6页,共83页，2024年2月25日，星期天一、液相色谱的速率理论

H=A＋B/u＋C·u

涡流扩散项：

A=2

dp

减小A的方法：填充物的平均直径dp=3～20um，均匀填充（匀浆装柱）§10-1液相色谱的柱效第7页,共83页，2024年2月25日，星期天HPLC中载体粒径对H的影响第8页,共83页，2024年2月25日，星期天HPLC中载体粒径对n的影响第9页,共83页，2024年2月25日，星期天

分子扩散项（B/u）Cd:常数Dm：组分分子在流动相中的扩散系数第10页,共83页，2024年2月25日，星期天

分子扩散项:B/u→0GC:DgHPLC:Dm

Dm/Dg≈10－5

u实=3～10u最佳

B/u→0

Dmt柱温

粘度∝第11页,共83页，2024年2月25日，星期天固定相传质阻抗：

HsDs：组分分子在固定液内的扩散系数Cs

：与k有关的常数df：固定液液膜厚度（键合相df→0）第12页,共83页，2024年2月25日，星期天流动相传质阻力Cm是与容量因子有关的常数。Csm是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。流动相停滞区内传质阻力流动相流动区内传质阻力第13页,共83页，2024年2月25日，星期天流动相传质阻力示意图-01第14页,共83页，2024年2月25日，星期天流动相传质阻力示意图-02第15页,共83页，2024年2月25日，星期天降低板高提高柱效的方法可采用减小填料的孔穴深度、粒径，采用低粘度、低流速的流动相，适当提高柱温等方法。减小填料粒度是提高柱效的最有效途径。第16页,共83页，2024年2月25日，星期天液相速率方程式H=A+B/u+C·uB/u→0第17页,共83页，2024年2月25日，星期天H-uFigureofGCandHPLC第18页,共83页，2024年2月25日，星期天

二、液相色谱的柱外谱带展宽

柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰展宽。①柱前展宽：由进样引起直接把样品加在柱顶端。②柱后展宽：柱后接管和检测器流通池。由于流动相在管壁附近处的流速明显快于管中心区域的流速，从而导致柱外谱带展宽。第19页,共83页，2024年2月25日，星期天§10-2高效液相色谱仪

一高效液相色谱仪的组成部分

Ⅰ高压输液系统

Ⅱ进样系统

Ⅲ分离系统

Ⅳ检测系统

Ⅴ附属系统第20页,共83页，2024年2月25日，星期天记录仪检测器组分收集器进样器储液器高压泵梯度洗脱装置试样

色谱柱第21页,共83页，2024年2月25日，星期天二主要部件及作用

Ⅰ对高压泵的要求：

1）有足够的输出压力，25～40MPa；

2）输出流量恒定，其流量精度1%～2％；

3）输出流量范围可调；

4）压力平稳，无脉动；

5）泵室体积小（﹤0.5ml），抗腐蚀性强.（一）高压输液系统第22页,共83页，2024年2月25日，星期天

高压泵分类1、恒压泵分类：液压隔膜泵和气动放大泵。特点：恒压但不恒流。应用：匀浆装柱。

2、恒流泵分类：螺旋注射泵和柱塞往复泵。特点：恒流；受流动相性质影响小。应用：分析。第23页,共83页，2024年2月25日，星期天

柱塞往复泵示意图第24页,共83页，2024年2月25日，星期天㈡进样系统⑴注射器：停流时进样，不耐压。⑵六通阀：耐压；进样量准确；重复性好；可带压进样。第25页,共83页，2024年2月25日，星期天第26页,共83页，2024年2月25日，星期天

㈢色谱柱

材料：不锈钢柱，内壁需要高度光洁。柱规格：常量柱:=2.0～4.6mm,L=10～25cm

半微量柱：=1.0～1.5mm,L=10～20cm

毛细管柱：=0.5～1.0mm,L=30～75cm

实验室制备柱：=20～40mm,L=10～30cm第27页,共83页，2024年2月25日，星期天第28页,共83页，2024年2月25日，星期天色谱柱的填充1)干法装柱：dp＞20um2)湿法-----匀浆法：dp＜20um注：顶替液硅胶柱----------------脱水己烷键合固定相柱---------甲醇或丙酮离子交换树脂柱-------缓冲溶液第29页,共83页，2024年2月25日，星期天匀浆的制备与装柱

①匀浆剂：二氧六环和四氯化碳混合液为常用的匀浆剂。

②匀浆：将填料放入适量的匀浆剂中，用超声波处理，使之成为糊状的匀浆。③装柱：将匀浆装入匀浆罐中，用高压泵以600～1000kg/cm2的压强，将顶替液注入匀浆罐，把匀浆顶入色谱柱中。④结束：当压强降至100～200kg/cm2时，说明装柱完毕。第30页,共83页，2024年2月25日，星期天

匀浆装柱示意图第31页,共83页，2024年2月25日，星期天

㈣检测系统溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。

紫外检测器荧光检测器电化学检测器总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应。

介电常数检测器、示差折光检测器其它检测器：红外、HPLC-MS、HPLC-FTIR等。第32页,共83页，2024年2月25日，星期天紫外检测器

固定波长型可变波长型光电二极管阵列检测器液相色谱的检测器中，光学检测器使用占优势，紫外检测器的应用最广泛，大约占70％。第33页,共83页，2024年2月25日，星期天第34页,共83页，2024年2月25日，星期天三维图谱第35页,共83页，2024年2月25日，星期天第36页,共83页，2024年2月25日，星期天

示差折光率检测器几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g·cm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗，使用受到限制。第37页,共83页，2024年2月25日，星期天LC-MS联用技术第38页,共83页，2024年2月25日，星期天

（五）附属系统它包括脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置．其中梯度洗脱装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。梯度洗脱(gradselution)：就是在分离过程中使两种或两种以上不同性质但可以互溶的溶剂，按一定程序连续改变它们之间的混合比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。（应用于样品组分复杂，性质差别小即容量因子范围宽）第39页,共83页，2024年2月25日，星期天梯度洗脱第40页,共83页，2024年2月25日，星期天梯度洗脱装置第41页,共83页，2024年2月25日，星期天§10-3分配色谱分配色谱分为：液液色谱和化学键合色谱一、液-液分配色谱法（LLPC）

在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物．第42页,共83页，2024年2月25日，星期天1．分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数．所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分．第43页,共83页，2024年2月25日，星期天2．固定相

由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单．只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题．为了更好解决固定液在载体上流失问题．产生了化学键合固定相．它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法．第44页,共83页，2024年2月25日，星期天3．流动相

在液液色谱中为了避免固定液的流失．对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好．根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱．正相液相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。

其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。反相液相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。其流出顺序是极性大的先流出，极性小的后流出。第45页,共83页，2024年2月25日，星期天二、键合相色谱采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱．由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品．由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离．化学键合固定相：利用化学反应，通过化学键把各种不同的有机分子键合到载体表面上所形成的固定相称为化学键合固定相反向键合色谱法：固定相键合有疏水基团的色谱法。

正向键合色谱法：固定相键合有极性基团的色谱法第46页,共83页，2024年2月25日，星期天（一）化学键合固定相用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶．利用硅胶表面的硅醇基(Si-OH)与有机分子之间成键,即可得到各种性能的固定相．一般可分二类．1）疏水基团

如不同链长的烷烃（C8和C18．）和苯基等．（2）极性基团

如氨丙基（-C3H6NH2)，氰乙基(-C2H4CN)、二醇(-C3H6OCH2CHOHCH2OH)、氨基(-[CH2]3NH2)等．

第47页,共83页，2024年2月25日，星期天键合固定相的制备

R1、R2

：－CH3、－H、－Cl应用最广泛的是有机氯硅烷与硅胶表面反应形成的硅氧烷涂层（≡Si—O－Si－C）

这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点．能在70℃以下，pH=2~8范围内正常工作，应用较广泛.

第48页,共83页，2024年2月25日，星期天（二）固定相和流动相的选择分配色谱中要综合考虑反向物质、固定相和流动相三者之间分子的作用力才能获得好的分离效果。选择柱子类型方式：固定相的极性与分析物质的极性粗略匹配，用极性明显不同的流动相洗脱。如反向键合色谱多采用水－乙醇体系改善分辨率的三个途径：改变n、k和α。其中k很大程度上取决于流动相的组成，最易调节，是改善分辨率的首选方法。K最佳范围2～5，复杂组分可扩大到0.5～20第49页,共83页，2024年2月25日，星期天与溶质分子有强烈作用的溶剂称为极性溶剂。溶剂的极性可定量地用Snyder的极性指数P`描述。参数P`用物质在三种溶剂（二氧六环、硝基甲烷、乙醇）中溶解度来度量。极性指数不是连续递减，采用混合溶剂法，以达到所希望的极性指数。

P`AB=ψ`AP`A+ψ`BP`B

通过调节极性指数，进而调节k。改变选择性的最方便途径是，固定预确定的k值，改变流动相的化学性质。见P392第50页,共83页，2024年2月25日，星期天键合相色谱的最大优点：通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）．此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗．据统计，在高效液相色谱法中，约有8O％的分离问题是用键合相色谱法解决．此法的最大缺点：不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系．第51页,共83页，2024年2月25日，星期天三、洗脱物的流出顺序

把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般地，固定相的烷基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。反相键合相色谱1．分离机制：疏溶剂理论第52页,共83页，2024年2月25日，星期天4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）

例：水+甲醇，乙腈第53页,共83页，2024年2月25日，星期天正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小底剂+有机极性调节剂

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．出柱顺序：极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱第54页,共83页，2024年2月25日，星期天反相离子对色谱法

反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸2）影响k的因素a．与m的极性有关（同反相色谱）b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑3）适用：较强的有机酸、碱第55页,共83页，2024年2月25日，星期天§10-4液固吸附色谱法

液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心．液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的．一、固定相吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等．由于硅胶的优点较多，如试样容量大，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多．第56页,共83页，2024年2月25日，星期天硅胶的表面为硅醇和硅氧烷基一般认为，微酸性的硅醇官能团在分离中起重要作用，而硅氧烷基影响很少或没有影响。硅醇官能团在相邻硅原子上的酸性最强的羟基容易形成分子内氢键，引起色谱峰拖尾。通常加入极性改性剂（水）来避免化学吸附和色谱峰的拖尾。第57页,共83页，2024年2月25日，星期天二、保留机制当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子．同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子。于是，在固定相表面发生竞争吸附:

Xm+nMad=Xad+nMm第58页,共83页，2024年2月25日，星期天达平衡时：其中K为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱．K值小,则保留值弱，易于洗脱．试样中各组分据此得以分离．K值可通过吸附等温线数据求出．吸附剂吸附试样的能力取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样分子的组成和结构以及洗脱液的性质。第59页,共83页，2024年2月25日，星期天三、流动相一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂．在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂．洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量．ε0越大，表示洗脱剂的极性越强．吸附色谱中选择溶剂的方法：选择两个共存的溶剂，其中一个的强度参数ε0较大，另一个则很小，通过改变两种溶剂的体积，以获得适宜的k值。ε0增加0.05个单位，k值降低3～4倍。应用：最适宜分离溶解在非极性溶剂中，具有中等相对分子量且为非离子型的试样。特别适于分离异构体。第60页,共83页，2024年2月25日，星期天§10-5离子交换色谱和离子色谱利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法．凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离．它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子．因此，应用范围较广．第61页,共83页，2024年2月25日，星期天一、离子交换平衡

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换：

第62页,共83页，2024年2月25日，星期天一般形式：R一A＋B＝R－B＋A达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：KBA越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱．一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，K值就越大．离子交换色谱中，通过控制流动相中反离子的浓度、离子强度和离子类型等，可调整被分析组分的k值，获得好的选择性和柱效。第63页,共83页，2024年2月25日，星期天

二、固定相

作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）第64页,共83页，2024年2月25日，星期天3．流动相

离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）水的缓冲溶液。通过改变流动相中反离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加反离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-

所以用柠檬酸离子为反离子洗脱试样时要比用氟离子快．

第65页,共83页，2024年2月25日，星期天阳离子的滞留次序为：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg2+＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十

但差别不如阴离子明显．关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低PH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。第66页,共83页，2024年2月25日，星期天四、离子色谱法离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法．由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用中受到限制．例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术．他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂．第67页,共83页，2024年2月25日，星期天通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量．这种色谱技术称为离子色谱．若样品为阳离子，用无机酸（HCl)作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂．当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中：

R+-OH＋H+Cl-→R+-Cl十H2O

经抑制柱后，大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响．不再干扰测定。第68页,共83页，2024年2月25日，星期天若样品为阴离子，用碳酸氢钠作洗脱剂，抑制柱为酸性阳离子交换树脂．柱流出液在抑制柱中反应生成弱电解质H2CO3,对电导测定没有明显影响。双柱离子色谱在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱法．双柱法的优点：降低了流动相的总离子含量，提高了检测试样离子的灵敏度。双柱法的缺点：抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度．第69页,共83页，2024年2月25日，星期天单柱离子色谱（非抑制型离子色谱）只有一根分离柱，不用抑制柱流动相直接进入电导检测器。单柱离子色谱采用低浓度的洗脱液，以降低流出液的本底电导；采用低容量的离子交换树脂，使保留值保持不变。优点：减少了抑制柱带来的死体积，分离效率高，并能用普通HPLC改装，发展迅速。缺点：不能在高电导介质中测定低含量的离子。广泛用于分析痕量阴、阳离子。第70页,共83页，2024年2月25日，星期天§10-5尺寸排斥色谱尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离．与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的．

尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布．第71页,共83页，2024年2月25日，星期天一、分离原理尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法．其固定相为化学惰性多孔物质——凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大．凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱．这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出．

第72页,共83页，2024年2月25日，星期天分离原理色谱流出曲线b1b2

cbab3ca第73页,共83页，2024年2月25日，星期天第74页,共83页，2024年2月25日，星期天V0VpAC选择渗透全渗透排斥相对分子质量106107105104103洗脱体积AC第75页,共83页，2024年2月25日，星期天它具有其他液相色谱所没有的特点