荧光显微镜使用和显微摄影

荧光显微镜使用和显微摄影2、荧光显微镜的装置A、可以提供特定波长的光源装置，使被检物体得到理想的激发发出强的荧光。B、可以吸收或反射短波光的一系列滤光片。第2页,共56页，2024年2月25日，星期天第3页,共56页，2024年2月25日，星期天第4页,共56页，2024年2月25日，星期天八、倒置显微镜第5页,共56页，2024年2月25日，星期天九、显微摄影1、按不同类型显微镜的调节方式，对拍摄部位初步对焦。2、视场光阑内切。3、选择光路（包括显微镜的与取景器旁的）4、安装胶卷5、设置自动曝光装置6、彩色照像要调色温，调电压或用滤光片第6页,共56页，2024年2月25日，星期天7、屈光度调节8、按曝光按钮9、取出胶卷第7页,共56页，2024年2月25日，星期天第8页,共56页，2024年2月25日，星期天生物电子显微镜技术

第一节透射电子显微镜技术一、显微镜的分辨率与放大倍数分辨率：d=0.61λ/η·sinα第9页,共56页，2024年2月25日，星期天电子的波长：

λ=h/mv

h—普朗常数,6.62×10-27尔格/秒

m—电子质量,9.1×10-28

克

v—电子运动速度根据能量守恒定理：

1/2mv2=eU

e—电子电量,4.8×10-10

静电单位

U—电压第10页,共56页，2024年2月25日，星期天

电子显微镜的电压50—100千伏。电子波长为0.053—0.007Å。最佳孔径角为10-2—10-3弧度。电镜的最高分辨率可达2—3Å。有效放大倍数可达100万倍。

12.25λ=(Å)U第11页,共56页，2024年2月25日，星期天入射电子直接透射电子小角度弹性碰撞电子大角度弹性碰撞电子小角度非弹性碰撞电子背散射电子俄歇电子二次电子阴极发光X—射线扫描电镜透射电镜

1、电子与样品作用后产生的信息X—射线能谱分析二、电子成像原理样品第12页,共56页，2024年2月25日，星期天2、样品的成像样品中质量密度小的区域，电子直接透射，形成亮区。样品中质量密度大的区域，由于电子散射，形成暗区。

3、电磁透镜的放大作用电子显微镜的透镜：电子的外加磁场。第13页,共56页，2024年2月25日，星期天磁透镜使电子会聚的原理OO’z电子在磁透镜中的运动轨迹AC第14页,共56页，2024年2月25日，星期天所有从O点出发的电子类似的轨迹运动，在v一定时，当轨迹与轴的角度很小时，电子会聚在O’点（O）的象。O象物O’baα平行光轴电子束经透镜成象a-b为磁场作用区域。第15页,共56页，2024年2月25日，星期天三、电镜的像差

1、球差球差是由于电子透镜的中心区域和边沿区域对电子的会聚能力不同而造成的。远轴的电子通过透镜时折射得比近轴电子要厉害的多，以致两者不交在一点上，结果在象平面成了一个满散圆斑2、衍射差电子通过光阑发生衍射。增大孔径角可以减小衍射差。最佳孔径角为10-2—10-3弧度。第16页,共56页，2024年2月25日，星期天αP’象P’’透镜物P光轴球差第17页,共56页，2024年2月25日，星期天3、色差入射电子的速度不同，未能会聚于一点。电子的能量不同，从而波长不一造成的，电子透镜的焦距随着电子能量而改变，因此，能量不同的电子束将沿不同的轨迹运动。第18页,共56页，2024年2月25日，星期天能量为E的电子轨迹象1透镜物P光轴色差能量为E-E的电子轨迹象2第19页,共56页，2024年2月25日，星期天4、象散磁场不对称时，就出现象散。圆形物点的象就变成了椭圆形的漫散圆斑消像散器可减弱。第20页,共56页，2024年2月25日，星期天平面BPA透镜平面物P光轴PBfA平面A象散第21页,共56页，2024年2月25日，星期天四、透射电子显微镜的结构电子光学系统、真空系统、供电系统电子光学系统照明系统成像系统观察记录系统电子枪聚光镜样品室物镜第一中间镜第二中间镜投影镜观察室照相舱自动曝光装置（一）电子光学系统第22页,共56页，2024年2月25日，星期天

1、照明系统

a、电子枪阴极、阳极、栅极阴极：0.1mm粗的钨丝，v型，2,227ºC时，产生电子发射。阳极：相对于阴极有50—100千伏的正电位差，加速电子流。栅极：相对于阴极有100—500伏的负电位。调节到达阳极的电子量，并使电子束会聚一点。阴极阳极栅极第23页,共56页，2024年2月25日，星期天

b、聚光镜两个电磁透镜聚光镜的作用是将电子束会聚在样品上，控制照明束斑的大小及孔径角。第24页,共56页，2024年2月25日，星期天

2、成像与放大系统

a、样品室插入支持铜网的样品臂。b、物镜短焦距的强磁透镜，安装了光阑和消像散器，决定分辨率。首次成像，放大100Х第25页,共56页，2024年2月25日，星期天c、中间镜及投影镜中间镜：弱透镜，放大20X，用来调节放大倍数。中间镜越多放大倍数越大。透射电镜成像的三级放大投影镜：高倍放大透镜，放大100X，越复杂的电镜投影镜越多。第26页,共56页，2024年2月25日，星期天3、观察记录系统

a、观察室观察室前方挡紫外线的铅玻璃，用于肉眼观察。底面是荧光屏，投射镜产生的最终放大像形成在荧光屏上。

b、照相舱在观察室下面，装有底片。第27页,共56页，2024年2月25日，星期天1、高压电线2、电子枪室3、第一聚光镜4、第二聚光镜5、光阑6、样品臂7、物镜8、第一中间镜9、第二中间镜10、投影镜11、观察窗12、观察室13、荧光板14、底片盒照明系统放大系统观察记录系统第28页,共56页，2024年2月25日，星期天(二)真空系统真空泵（机械泵）油扩散泵真空系统管道及自动伐门预抽室、空气干燥器真空检测系统第29页,共56页，2024年2月25日，星期天(三)电源系统高压电源电源系统透镜电源附属电源第30页,共56页，2024年2月25日，星期天第31页,共56页，2024年2月25日，星期天第32页,共56页，2024年2月25日，星期天光源中间象物镜样品聚光镜目镜电子枪聚光镜样品物镜中间象投影镜观察屏照相底板虚象第33页,共56页，2024年2月25日，星期天三、透射电镜的样品制作（一）超薄切片法主要步骤：取材固定洗涤脱水浸透包埋聚合修块切片装网电子染色上镜观察1、取材

1mm3（或mm2）活体取材，低温，4ºC。刀片锋利，动作轻巧迅速。第34页,共56页，2024年2月25日，星期天2、固定电镜常用固定剂：戊二醛、锇酸固定方法：

戊二醛—锇酸双固定第35页,共56页，2024年2月25日，星期天前固定

2.5%戊二醛溶液，4ºC，1—4小时。洗涤0.2M磷酸缓冲液，pH7.4，5—6次，每次10分钟。后固定

1%的锇酸溶液，4ºC，1小时。洗涤0.2M磷酸缓冲液，pH7.4，3—4次，每次10分钟。第36页,共56页，2024年2月25日，星期天c、注意事项温度在低温下进行，4ºC。时间与固定液的浓度、种类有关。不可随意更改。固定液的pH接近组织的pH。固定液的浓度浓度过低，会发生组织肿胀、抽提；浓度过高，组织收缩或遭破坏。固定液的渗透压应该接近组织液的渗透压。第37页,共56页，2024年2月25日，星期天3、脱水一定浓度的酒精或丙酮系列30%50%70%80%90%95%100%（2-3次），每步5—15分钟。注意：

a、70%脱水剂以上各步都在低温（4ºC）下进行。b、样品只有在70%脱水剂，4ºC可以存放过夜。c、脱水要彻底。第38页,共56页，2024年2月25日，星期天4、浸透

包埋剂成分：树脂单体（环氧树脂618#、Epon812等）、固化剂、增塑剂及加速剂。注意事项：浸透要充分；包埋剂配制时要混匀各种成分；用具要干燥，防止包埋剂吸潮。浸透过程：无水丙酮½无水丙酮+1/2包埋剂（4小时）纯包埋剂（过夜）。第39页,共56页，2024年2月25日，星期天5、包埋与聚合包埋模包埋，加温聚合。注意：防止产生气泡；包埋后要干燥，防止吸潮。第40页,共56页，2024年2月25日，星期天6、修块注意事项：尽量削去样品周围的空白介质，顶面呈梯形或方形，大小1mm²。梯形或方形的上下两边平行。第41页,共56页，2024年2月25日，星期天7、切片切片刀有钻石刀和玻璃刀。

注意事项：切片刀要锋利，否则切片上会出现划痕。切片厚度500—1000Å，面积1mm²以下。切片连成带浮在水面上。第42页,共56页，2024年2月25日，星期天第43页,共56页，2024年2月25日，星期天8、装网载网的类型：第44页,共56页，2024年2月25日，星期天Formvar膜的制备：配制0.3%Formvar（聚乙烯醇缩甲醛）的二氯乙烷（或氯仿）溶液。切片用带膜的铜网捞取，在显微镜下进行。第45页,共56页，2024年2月25日，星期天

9、电子染色醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色。10、上镜观察第46页,共56页，2024年2月25日，星期天（二）负染色技术所谓负染色，负染色技术又称为阴性染色术。是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。磷钨酸滴染

第47页,共56页，2024年2月25日，星期天第二节扫描电子显微镜技术一、扫描电镜的结构电子光学系统信号的收集转换系统信号的显示与记录系统。真空和供电系统电子枪电磁透镜扫描线圈第48页,共56页，2024年2月25日，星期天样品入射电子直接透射电子小角度弹性