实用免疫细胞与核酸课件模板-062(共116)

1、实用免疫细胞与核酸 课件模板-62,实用免疫细胞与核酸：二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用,二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用：,目前的研究指出，用免疫细胞化学检查病人血清中的dsDNA抗体为作为系统性红斑狼疮的诊断依据之一。佐佐木毅等和徐世玉等发现一些临床症状和血清学检查不典型的红斑狼疮病人，在发病早期就出现抗dsDNA抗体，认为这可能有助于早期诊断。 1。用马疫锥虫抗原检测抗dsDNA抗体方法 （1）底物制备：用马疫锥虫感染小鼠24天后，取小鼠的外周血

2、，按血液细胞计数法作马疫锥虫计数，达到4.31065.6106时即采尾血涂片，空气干燥后直接使用或4保存备用。,实用免疫细胞与核酸：二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用,二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用：,（2）方法和结果：血涂片加入少量水溶去红细胞，待干。加入一滴被检血清于其上，移湿盒中，在室温中3040min，用0.01mol/lpH7.4PBS洗510min，取出吸干，加兔抗人IgG荧光抗体，在湿盒中染色3045min，再按上法洗片，待干，荧光显微镜

3、检查。阳性者可见锥虫的核及动基体发出明亮绿色荧光。,实用免疫细胞与核酸：二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用,二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用：,2。用短膜虫抗原检测抗dsDNA抗体方法 （1）底物制备：用北京生物制品研究所制备的短膜虫涂片标本作抗原。 （2）方法和结果：用上述马疫锥虫抗原的间接免疫荧光染色法。短膜虫是一种血鞭毛虫，动基体中含纯净的dsDNA可作为抗原，阳性结果可见虫体近尾或中部有一致密荧光亮点，为动基体，近头部有一淡绿色亮点，为细胞核。,

4、实用免疫细胞与核酸：二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用,二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用：,阴性结果动基体上无荧光。阳性血清自1：5稀释，测定效价。 3。用酸洗脱鼠肝细胞抗原检测抗dsDNA抗体方法（参考Ta的方法） （1）底物准备：将6个月小白鼠剪断上腔静脉，立即用0.01mol/l pH7.4 的PBS从门静脉灌洗至鼠肝发白，取出肝组织剪成接触面为0.15cm0.5cm的小块，印片，空气中干燥后用丙酮固定10min，再空气干燥。,实用免疫细胞与核酸：

5、二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用,二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用：,浸入0.1mol/l HCl中洗脱30min，并轻轻的摇动，随后，再用0.15mol/l PBS pH7.4洗2次，每次10min，再用0.01mol/l pH7.6的PBS洗5min，空气干燥。即可用或在4中贮存。 （2）方法和结果：用间接免疫荧光法检测，阳性结果可见细胞核呈黄绿色荧光。,实用免疫细胞与核酸：二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody,

6、 dsDNA）的检测方法和应用,二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用：,用酸洗脱鼠肝细胞标本作抗原与马疫锥虫、短膜虫法比较结果，和马疫锥虫法符合率达93%，其中马疫锥虫法4例阳性，为系统性硬皮病，而此法为阴性，说明此法较马疫锥虫法更特异。此法与短膜虫法比较，符合率为95%，P0.05，说明二法无显著差别。其中此法阳性而短膜虫法阴性的3例，均符合系统性红斑狼疮诊断，并均有肾损害。,实用免疫细胞与核酸：二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用,二、双链DNA抗体（Do

7、uble strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用：,短膜虫法阳性而此法阴性的6例均为待查病例，不能证实为系统红斑狼疮诊断，说明此法在特异性方面更佳。,实用免疫细胞与核酸：三、抗核仁抗体的检测法,三、抗核仁抗体的检测法：,用HEP-2细胞或大鼠肝细胞作抗原，作间接免疫荧光染色。结果可见细胞核核仁呈现明亮的黄绿色荧光。抗核仁抗体在硬皮病、皮肌炎、系统性硬化症等中最多见。,实用免疫细胞与核酸：四、抗组蛋白抗体的检测方法,四、抗组蛋白抗体的检测方法：,1。组蛋白的提取方法取大白鼠肝40g加入160ml0.01mol/l Ph7.4 Tris HCl缓冲液，制成匀浆后进行

8、浓度梯度离心（27000rpm60min），沉淀物中加入蒸馏水90ml，再以超声粉碎仪将细胞打碎，离心（3000rpm15min）取上清液，再加入一定量的1mol/l 硫酸，使硫酸的最终浓度为0.2mol/L,混匀后，离心（3000rpm15min），取上清液，加入45倍体积的无水乙醇，置于-20冰箱3天后，离心（3000rpm15min）以乙醚洗涤沉淀，真空干燥，储存于-20冰箱中备用。,实用免疫细胞与核酸：四、抗组蛋白抗体的检测方法,四、抗组蛋白抗体的检测方法：,2。酸处理的鼠肾底物 鼠肾冰冻切片（厚度4m），以丙酮固定后吹干，密封，在-20冰箱中储存备用。用前再于0.1mol/L盐酸中浸

9、泡30min，然后再置于0.01mol/l pH7.4PBS中浸泡2次。 3。组蛋白重建的鼠肾底物在上述酸处理的鼠肾底物上加入30l乙制备好的组蛋白，稀释浓度为25l/ml，在室温中湿盒内孵育30min后，以0.01mol/l p7.4PBS浸2次。,实用免疫细胞与核酸：四、抗组蛋白抗体的检测方法,四、抗组蛋白抗体的检测方法：,4。检测方法用组蛋白重建的鼠肾底物，做间接免疫荧光测定。 5。结果1960年Kunkle首先在SLE中发现抗组蛋白抗体（Antihistone antibody ,AHA），是诊断药物性SLE的一项较好的指标。在活动期SLE中AHA可达90%。,实用免疫细胞与核酸：五、

10、抗着丝点抗体的检测方法,五、抗着丝点抗体的检测方法：,1。HEP-2细胞涂片的制备HEP-2细胞系人喉癌上皮细胞，在完全Eagle培养液中，37，二氧化碳孵育4872h，使细胞生长达到一定数量，约1.21.5106/ml，经胰酶消化后，可以传代或分装到置有玻片的培养皿中，继续用Eagle液培养及上述条件孵育，48h细胞不仅贴附于玻片上并已长成单细胞层。,实用免疫细胞与核酸：五、抗着丝点抗体的检测方法,五、抗着丝点抗体的检测方法：,取出玻片用丙酮固定15min，自然干燥后待用，或保存于-20或4中。 表15-3 各种抗核抗体及临床意义 抗体名别名临床意义抗Sm抗体SLE标记抗体，阳性率1528%

11、，常伴抗RNP抗体，有补体减少及肾受累抗RNP抗体抗U1-snRNP抗体抗MO抗体各种自身免疫病均可出现，单独高效价见于混合结缔组织病（MCTD）。,实用免疫细胞与核酸：五、抗着丝点抗体的检测方法,五、抗着丝点抗体的检测方法：,抗SS-B抗体抗La抗体干燥综合征的标记抗体（27%）抗Ha抗体SLE 5%，同时抗SS-A阳性抗SS-A抗体抗RO抗体干燥综合征为78%阳性，SLE49%系统性硬皮病23%抗Scl-70抗体抗Og抗体系统性硬皮病的标记抗体44%抗Scl-86抗体抗Scl-抗体阳性系统性硬皮病进行性。,实用免疫细胞与核酸：五、抗着丝点抗体的检测方法,五、抗着丝点抗体的检测方法：,局部者

12、阴性。抗Ki抗体SLE特有12%阳性。抗PCNA抗体抗Ne抗体SLE阳性1%。抗JO-1抗体多发性肌炎的标记抗本（24%），阳性者多有肺病变抗KO-1抗体多发性肌炎60%抗PM-1抗体多见于系统性硬皮症（55%）抗Ma抗体分类不明的胶原病抗MOS抗体同上抗RANA抗体抗SS-C抗体类风湿性关节炎80%90%抗dsDNA抗体SLE所特有60%抗ssDNA抗体见于各种胶原病 注：Sm（Smith）；RNP：核糖核蛋白；Sn：为小核；SSB：干燥综合征B；SS-A：干燥综合征-A，Scl-70：硬皮病70，抗原分子量70000；PCNA：增殖细胞抗原；PM-1：多发性肌炎-；RANA：类风湿性关节核

13、抗原；dsDNA：双链DNA；ssDNA：单链DNA。,实用免疫细胞与核酸：五、抗着丝点抗体的检测方法,五、抗着丝点抗体的检测方法：,2。染色方法用间接免疫荧光法。 3。结果着丝点抗原是紧附于染色体着丝点的DNA蛋白质，当与相应抗体结合后荧光图型为约46个圆的荧光亮点。国际上多用HEP-2细胞，因这种细胞核大，分裂相旺盛，着丝点容易显露，这种抗体在进行性系统性硬化症（PSS）中阳性率可达31%98%，是PSS的CREST型的标记抗体，CRESF是指具有软组织钙化，雷诺现象，食管功能低下，指端硬化，毛细血管扩张的PSS患者。,实用免疫细胞与核酸：六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoant

14、iodies）的检测方法,六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法：,Roitt等（1956）和Witebsby等（1957）就发现桥本氏病人血清中有对甲状腺提取的抗体活性，后来White（1957）首次用间接免疫荧光染色方法研究桥本氏病人血清存在对甲状腺胶质（thyroidcolloid）的抗体获得成功。此后，Landing等（1958）和Holbrow等（1959）以不固定的甲状腺切片作抗原。,实用免疫细胞与核酸：六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法,六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检

15、测方法：,检查出慢性甲状腺炎（Chronie thyroiditis）病人血清中有和细胞浆结合而呈现明亮染色的抗体。Blizzard等（1960）,Doniach 等（1960）发现第二胶质抗体，血高球蛋白，沉淀素阴性，鞣酸细胞血凝试验阴性，抗甲状腺微粒体补体结合试验阴性。Balfoour等（1961）用免疫荧光法研究一些甲状腺病人时总结指出：甲状腺胶质抗体有三种不同的荧光形态：一种是呈三维状云絮状，是一种血清沉淀素阳性产生的抗甲状腺球蛋白抗体。,实用免疫细胞与核酸：六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法,六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoanti

16、odies）的检测方法：,另一种是胶质部分荧光呈裂纹形，胶质无明显阳性荧光，而胶质边缘和裂纹处呈明亮荧光，鞣酸化细胞血凝反应阳性，沉淀素反应阴性。第三种即上述的胶质呈均匀荧光形状，证实这是一种称第二胶质的抗体。近30多年的研究证明免疫荧光方法检查甲状腺自身抗体是一个特异、敏感、简便的方法，对于临床诊断和治疗，随访和预后，甲状腺某些疾病的自身免疫性质的发病机理研究等，都有一定的实用价值。,实用免疫细胞与核酸：六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法,六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法：,我们20年大量研究结果也证明确实如此

17、。用免疫荧光法检查甲状腺自身抗体已成为许多国家中，诊断甲状腺疾病的常规检查项目之一。 检查这种抗体的免疫荧光方法要求取正常人的甲状腺或手术摘出的甲状腺组织，用冰冻节片（36m）用作甲状腺球蛋白抗体检查切片需要经56纯甲醇固定3min；用作甲状腺微粒体抗原切片无需固定处理，因固定会破坏微粒体的抗原性。,实用免疫细胞与核酸：六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法,六、抗甲状腺自身抗体（ThyroidAutoantiodies）的检测方法：,按常规间接方法进行。 关于甲状腺抗体的研究已报告有甲状腺球蛋白抗体，微粒体抗体，第二胶质抗体，甲状腺刺激免疫球蛋白抗体，甲状

18、腺激素T4及T3抗体，细胞表面的促甲状腺激素受体的抗体等。 表15-4 不同甲状腺疾病甲状腺自身抗体的阳性率（%） 诊断甲状腺上皮微粒体抗体（%）甲状腺球蛋白抗体（%）甲状腺抗体总阳性率（%）LATS（%）桥本氏病897898Gravess病37855380原发性甲低575275正常对照576。,实用免疫细胞与核酸：七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测,七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测：,Johnson（1965）首次用免疫荧光组织化学间接法在狼疮样肝炎病人血清中发现了SMA，用鼠胃滑肌作抗原。Whit

19、ingham用病人自身平滑肌作抗原，证实了SMA的自身免疫性。狼疮性肝炎或慢性活动性肝炎病人血清中SMA的阳性率可达80%以上。Donidht和Whitehouse先后报告了急生病毒性肝炎病人血清中SMA为IgM，而慢性活动性肝炎病人血清中SMA在发病初期（14期）为IgM，而后为IgG。,实用免疫细胞与核酸：七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测,七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测：,Anderson利用纯化肌浆蛋白为抗原与肝炎病人血清中分离的IgM和IgM类SMA进行吸收试验，证明了SMA的特异性。Ho

20、lborrow Gamel和Renbe先后观察了SMA与鼠肝细胞，肾小球及人的甲状腺上皮细胞和血小板等组织为抗原的免疫荧光染色结果，证明这些组织的抗原性均与平滑肌肌动蛋白有着共同性抗原。,实用免疫细胞与核酸：七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测,七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测：,现在多以大白鼠胃壁和肾组织血管壁平滑肌的46m冰冻切片和抗原，附贴在干净的盖玻片上，电扇吹干，放入4干燥剂中保存，用前可固定于95%（4）酒精中1min，或不固定进行间接免疫荧光检测。 染色结果可见胃壁平滑肌，粘膜肌层和肌丝，小血管壁平滑肌等呈现出明亮的黄绿色荧光。有人用荧光检查急性期甲、乙二型肝炎暂时出现SMA的阳性率达80%，稀释血清应在1：10以上的确定为阳性，一般认为，肝细胞表面存在肌动蛋白样物质。,实用免疫细胞与核酸：七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测,七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测：,慢性活动肝炎