中国玉米南方锈病病原菌遗传多样性VIP

中国农业科学2013，46(21)：45234533 Scientia Agricultura Sinica doi：103864issn05781752201321015 中国玉米南方锈病病原菌遗传多样性 郭云燕 ，陈茂功2 7孙素丽 ，武小菲 ，江凯 ，朱振东 ，李洪杰2何月秋 ，王晓鸣 ( 云南农业大学植物保护学院，昆明650201； 中国农业科学院作物科学研究所国家农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 北京100081) 摘要：【目的】针对近年频繁暴发的玉米南方锈病，通过分子生物学技术，明确不同地区玉米南方锈病菌的 遗传相似性，为研究该病害流行与发生规律和抗病育种提供信息。【方法】利用18对多态性ISSR引物对2011和 2012年采集自12个省(自治区、直辖市)的72个菌株进行扩增，分析种群的遗传结构与特征。【结果】在相似 系数081水平上，72个菌株被划为2群5亚群10组，亚群间表现出年度与地域的一定差异；遗传多样性分析表 明菌株群体间存在较高的遗传变异；遗传相似性和遗传距离分析揭示山东与安徽、福建与浙江群体分别具有相对 较高的相似性，而海南群体与其它群体遗传距离最远；不同地区病菌群体问缺乏基因交流，遗传相关性较低。【结 论】引起中国不同地区玉米南方锈病的多堆柄锈菌群体具有较高的遗传变异；病菌遗传多样性分析结果初步证明， 各地病菌无法在当地完成周年侵染循环；海南三亚冬季发生的玉米南方锈病不是中国其它地区病害的初侵染源， 广东和广西等华南地区的玉米锈病也不是黄淮夏玉米区病害的初侵染源，中国大陆地区和海南岛的玉米南方锈病 的初侵染源可能来自于中国大陆以外的其它地区。 关键词：玉米南方锈病；多堆柄锈菌；遗传多样性；ISSR Genetic Diversity of Puccinia polysora Underwin China GUO Yunyan 1,2 CHEN Maogong2b sUN Suli，WU Xiaofei ，JnNq Kai ，ZHU Zhendong ， LI Hongie。，HE Yue-qiu ，WANG Xiaoming。 ( College ofPlantProtection，YunnanAgricultural University,Kunming 650201；2nstitute ofCrop Scienceational KeyFacilityofCropGeneResourcesandGeneticImprovement,ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Beijing 100081) Abstract：ObjectiveThe objective ofthis study is to understand the genetic diversity ofPucciniapolysora，the causal agent of Southern corn rust which is outbreaked recently in China，molecular techniques were used to analyze the genetic differences among the pathogen populationsMethodSeventytwo populations ofP polysora，collected from twelve provinces during 2011 and 2012，were amplified using eighteen polymorphic ISSR primers and the results were analyzed with softwareResult Seventy-two populations were clustered into ten branches at 8 1DiceS similarity coefficient，including two groups and five subgroupsThere were some relationships in subgroup populations on collected loci and years and the higher genetic variations were tested among different populationsThe higher genetic similarities were detected between Shandong and Anhui，Fujian and Zhejiang populations respectively,and the lowest similarities were between Hainan and othersThe genetic relationship between provincial populations was lower based on the gene flow informationConclusionThere were higher genetic variations in populations ofP polysora，causal agent of southern COrn rust，in ChinaBased on the molecular data，the pathogen did not complete the disease cycle in the field，and the population of P polysora in Hainan was not the primary infection source in other provinces as well as the populations of P polysora in Guangdong and Guangxi were not for summer-growing maize areaIt was concluded that the primary 收稿日期：2013-0311；接受日期：2013-0528 基金项目：国家现代农业(玉米)产业技术体系(CARS一02) 联系方式：郭云燕，Email：vvccqq222163com。通信作者王晓鸣，TelEmailwangxiaomingcaascn 4524 中国农业科学 46卷 infection source ofPpolys0ra in mainland and Hainan island ofChina might come from other areas Key words：Southern corn rust；Pucciniapolysora；genetic diversity；ISSR 0 引言 【研究意义】玉米南方锈病(Southern com rust) 是由多堆柄锈菌(PucciniapolysoraUnderw)引起的 世界性病害，近年来在中国发生呈上升趋势。自20 世纪90年代以来，南方锈病在河南南部、山东南部、 安徽北部、江苏北部玉米主产区以及广东和广西局部 时常暴发，对玉米生产的威胁明显增大，已成为中国 夏玉米区和南方玉米区的主要病害。玉米南方锈病 的暴发具有地域性和间歇性，该病害在中国的发生与 流行规律迄今尚不清楚。南方锈病病菌侵染玉米植株 的所有地上部绿色组织，病害严重发生时，病菌橘黄 色的夏孢子堆和夏孢子完全覆盖感病玉米的叶片，导 致叶片干枯，植株早衰，造成减产，是3种玉米锈病 中最具破坏性的病害2】。研究中国南方锈病发生地区 病原菌群体的遗传多样性，将有助于了解各地病菌的 遗传结构，明确不同地域种群间的遗传关系，探讨病 菌变异的原因，为育种家制定选育抗病品种的策略、 为研究病害的流行动态与发生规律以及为制定有效的 病害预测预报技术与田问控制措施提供重要的基础信 息。【前人研究进展】自20世纪80年代后，南方锈 病在中国开始间歇性暴发，引起了人们的关注和研究。 阮义理等31通过对田间植株、采集病叶的系统观察和 对病菌夏孢子存活力的检测，推测病菌在浙江无法越 冬，初侵染源应来自南方地区气流所携带的夏孢子； 石洁等 1依据研究结果，推断南方低纬度地区冬玉米 上的南方锈病是其它地区玉米南方锈病的初侵染源。 本课题组早期的研究表明，不同地区采集的病菌存在 遗传变异，病菌的变异具有较明显的地域性(数据未 发表)。Unangam等5】采用5对ISSR引物对来自泰 国8省的36份玉米南方锈病菌菌株进行扩增，结论为 病菌群体具有较好的多样性，但不同地域的病菌在聚 类时出现交叉，表明泰国的病菌通过气流作用进行传 播，导致病菌多样性的差异在地区问表现不显著；这 是第1份关于玉米南方锈病病菌遗传结构的系统研究 报告。邢国珍L61通过比较采白海南、河南和重庆的少 量菌株，通过ITS区段和 tubulin基因的序列分析， 认为病菌的遗传多样性不丰富，病菌缺乏地区间的分 化。【本研究切入点】玉米南方锈病在中国的主要发 生区域为东部和南部沿海省份及安徽、河南、河北局 部地区，在贵州、云南、湖南些地区有零星发牛。 由于国际上南方锈病病菌牛理小种鉴别寄主的缺失和 病菌无法低温保存，对病菌的变异研究较为困难。采 用分子技术研究中国玉米南方锈病主要发生区域病菌 的遗传多样性，利用病菌多样性信息解析病害发生的 基本特征，将极可能是未来深入研究该病害的重要途 径。【拟解决的关键问题】利用18对ISSR引物对在 中国玉米南方锈病发生区域广泛采集的病菌菌株进行 遗传多样性研究，以期通过不同地域间、不同年份间 病菌的遗传变异分析，初步揭示中国玉米南方锈病发 生与流行的规律，为未来的病害防控、抗病育种及相 关研究提供重要信息。 1材料与方法 试验于2011年7月至2013年5月在中国农业科 学院作物科学研究所完成。 11 多堆柄锈菌夏孢子的获取和鉴定 201 1、2012年通过广泛的田间调查，采集玉米南 方锈病发病田的玉米病叶。病叶携带回实验室后，以 湿纱布擦拭叶片表面的夏孢子堆，然后用蒸馏水洗脱 纱布上的夏孢子，再将孢子液分别经300目和800目 孔径的不锈钢筛过滤，以清除混在孢子液中的 Bipolaris等真菌的分生孢子。过筛后的夏孢子液转入 100 mL的试管中并在1 500 rmin下离心35 min (LD52A，北京医用离心机厂)，吸除试管上部的液 体，将夏孢子沉淀风干，然后于80C保存备用或直接 用于提取DNA。利用特异性分子检测技术I 对所有采 集获得的菌株进行种的鉴定，最终确定为多堆柄锈菌 分离物的样本用于遗传多样性检测。 12多态性l SSR引物筛选 采用CTAB法提取病菌夏孢子基因组DNA。选 择采白不同地区的6个菌株，对加拿大哥伦比亚大学 (University ofBritish Columbia，UBC)公布的90对 ISSR(inter simple sequence repeat)引物进行初步筛选， 选择扩增条带丰富、带型清晰的引物备用。PCR反应 体系为25 gL：DNA模板(20ng)10 ，ISSR多态 性引物(02 gmolL。)40 ，dNTP(200 gmolL ) 20 gL，Taq酶(25 UpL。)10 gL，buffer(含Mg ) 25 pL，ddH2O 145 gL。PCR反应在基因扩增仪(T1 型，Biomea)上进行，反应程序如下：94预变性4 4526 中国农业科学 46卷 BJ01a HB01a HB02a JS01a JS02a JS03a JS04a JS05a JSO6b ZJO1a ZJ02a ZJ03a 04a ZJ05b ZJ06b ZJ07b ZJ08b AHO1a AH02a AH03a AH04a AH05b AH06b FJ01a FJ02a FJ03b FJO4b FJ05b SD01a SD02a SD03a SD04a SD05a SD06a SD07a S13108a SI3IO9 SD10a SD11a SD12b 北京市昌平区Changping，Beijing 河北省邢台市桥西区Qiaoxi，xingtai，Hebei 河北省邯郸市邯郸县Handan，Handan，Hebei 江苏省宿迁市沭阳县Shuyang，Suqian，Jiangsu 江苏省宿迁市沭阳县Shuyang，Suqian，Jiangsu 江苏省南通市海门市Haimen，Nantong，Jiangsu 汀苏省徐州市铜山区Tongshan，Xuzhou，Jiangsu 江苏省南京市玄武区Xuanwu，Namg，Jiangsu 江苏省无锡市江阴市Jiangyin，Wuxi，Jiangsu 浙江省金华市东阳市Dongyang，Jinhua，Zhiang 浙江省金华市东阳市Dongyang，Jinhua，Zhang 浙江省金华市东阳市Dongyang，Jinhua，Zhiang 浙江省绍兴市诸暨市zhuji，Shaoxing，Zhiang 浙江省金华市东阳市Dongyang，Jinhua，Zhiang 浙江省金华市东阳节Dongyang，Jinhua，Zhiang 浙江省金华市磐安县Panan，Jinhua，Zhiang 浙江省绍兴市诸暨市Zhuji，Shaoxing，Zhang 安徽省宿州市萧县Xiaoxian，Suzhou，Anhui 安徽省宿州市蛹桥区Yongqiao，Suzhou，Anhui 安徽省阜阳市涡阳县Woyang，Fuyang，Anhui 安徽省毫州市谯城区Qiaocheng，Bozhou，Anhui 安徽省宿州市萧县Xiaoxian，Suzhou，Anhui 安徽省宿州市埔桥区Yongqiao，Suzhou，Anhui 福建省三明市沙县Shaxian，Sanming，Fujian 福建省福州市晋安区Jinan，Fuzhou，Fujian 福建省福州市晋安区Jinan，Fuzhou，Fujian 福建省福州市罗源县Luoyuan，Fuzhou，Fujian 福建省福州市福清市Fuqing，Fuzhou，Fujian 山东省青岛市平度市Pingdu，Qingdao，Shandong 山东省青岛市莱西市Laixi，Qingdao，Shandong th东省德卅【市陵县Lingxian，Dezhou，Shandong 山东省德州市德城区Decheng，Dezhou，Shandong 山东省德州市武城县Wucheng，Dezhou，Shandong 山东省烟台市莱州市Laizhou，Yantai，Shandong 山东省临沂市兰山区Lanshan，Linyi，Shandong 山东省聊城市东吕府区Dongchangfu，Liaocheng，Shandong 山东省潍坊市寿光市Shouguang，Weifang，Shandong 山东省济南市长清区Changqing，Jinan，Shandong 山东省烟台市郭庄镇wuji，Yantai，Shandong 山东省烟台市莱州前Laizhou，Yantai，Shandong 2O1209 2Ol209 201209 2O1209 2O1209 201209 201209 2012 09 20l109 20l21O 20l210 2Ol210 201210 2O1110 2O1110 20l1一lO 201209 2O1209 201209 2Ol209 2O1109 2O1l一09 201210 201210 201ll0 201110 2O111O 201209 201209 2012O9 201209 20l209 2Ol209 2Ol210 201209 201209 20l209 2O1209 201109 7 3 3 5 5 7 5 7 5 3 3 5 7 5 7 7 9 3 3 3 5 3 3 3 7 7 7 5 3 3 5 3 5 5 3 3 5 3 3 3 21期 郭云燕等：中国玉米南方锈病病原菌遗传多样性4527 a：2012年采集菌株样本：b：2011年采集菌株样本 a：The strains collected in 2012；b：The strains collected in 2011 (A )为41 l一131 1，平均为861，有效等位基因数 目(胞)为136472，平均为279，NeiS(1973)基 因多样性指数( )为018O72，平均为051，Shannon 信息指数( )为025152，平均为090。以上结果表 明，在南方锈病病菌群体中，存在较高的遗传变异。 遗传多样性结果还表明，多堆柄锈菌遗传多样性 在不同地区种群之间有一定程度的差异。总体而言， 山东、河南和浙江种群遗传多样性较高，安徽和福建 种群为中等，广东、江苏和广西种群的遗传多样性略 低，而海南和河北种群遗传多样性最低。 21期 郭云燕等：中国玉米南方锈病病原菌遗传多样性4529 表4南方锈病菌株不同省份群体间的遗传相似性和遗传距离 Table 4 Genetic identity and genetic distance among provincial populations ofPpolys0 上方为遗传相似系数，下方为遗传距离Neis genetic identity(above diagona1)and genetic distance(below diagona1) 各地群体内，菌株存在小范围的变异。2011与2012 年菌株群体间的Gst值为04381，表明2年的菌株 之间有较大的分化；而在201 1年的菌株之间的Gst 值为06647，2012年菌株之间的Gst值为06369， 表明各年度内所采集菌株的相似性高于年度间的相 似性。2011与2012年菌株之间基因流Nml，表明 不同年度间菌群有较大的遗传差异；各地区间的玉 米南方锈菌的基因流Nm为080，也证明不同地区 群体间较少的基因交流，各地区菌株群体间的相关 性较低。 24多堆柄锈菌菌株聚类分析 在相似系数为081时，可将72个菌株聚为10组 (图3)。2011与2012年的菌株明显分为2群(Group)， Group 1为2012年的所有菌株和2011年的8个菌株 组成(其中5个为广东和广西菌株)，Group 2为2011 年不同地区的12个菌株组成。Group 1又分为3个亚 群(subgroup)，subgroup I为2012年采集的7个菌 株，主要来自浙江和福建；subgroup II为2012年采集 的45个菌株和2011年广西1个(GX03b)、海南1 个菌株(HN03b)构成，其中2012年的菌株主要是包 括广东的大部分菌株、河南的部分菌株、江苏的部分 菌株、山东的部分菌株、广西的菌株、河北的菌株和 北京的1个菌株(采自广西南宁，与GX02a同来源， 在北京接种后再从发病植株上采集)组成；而subgroup III 4530 中国农业科学 46卷 084 Coefficient 10O 图3 201 1201 2年玉米南方锈菌聚类结果 Fig3 Dendrogram ofPpolysora collected in 201 1 and 2012 由2011年采集的来自广东、浙江和山东5个菌株组成。 Group 2分为2个亚群(subgroup)，subgroup I主要 由山东、浙江部分菌株，河南、安徽和福建菌株组成； subgroup II由福建、江苏和山东菌株组成。综合表明， 多堆柄锈菌的地理种群之间有些表现出地域相邻，其 遗传关系较近、遗传相似度较高的特点，如浙江与福 建菌株、山东与河南菌株；然而同时存在有一些地理 I1 种群又表现为地域相邻但遗传关系较远、遗传相似度 较低的特点，如广西与广东；也存在地域相邻较远， 但菌株问遗传相似度较高的情况，如 一些广东与河南 菌株；与此同时，菌株间在年份上也表现出一定的遗 传距离。 201 1年菌株与2012年菌株在总体上表现为遗传相 似系数较低，表明2年的菌株原始来源可能存在不同。 21期 郭云燕等：中国玉米南方锈病病原菌遗传多样性 4531 但对于广西和海南两地的菌株而言，各自在201 1年的 菌株和2012年的菌株之问遗传相似系数较高，分别被 聚在1个相近的范围内，表明这2个地区不同年份间的 菌株可能有分别相近的地理来源。 3 讨论 31 玉米南方锈病病菌的遗传多样性与病害初侵染源 植物锈病是由具有专性寄生特性的锈菌所引起。 在气候四季分明的地区，锈菌或者通过产生具有抗逆 能力的冬孢子越冬而成为次年的初侵染源，或者以夏 孢子的形式随着气流从越冬的发病区逐步扩散而引 起病害流行。已有的研究和笔者实验室对南方锈病多 年的田间监测表明，在中国，不论是南方还是北方， 田间极难发现病菌在玉米植株新鲜的发病组织上或 遗留在田间的病残体上产生冬孢子，笔者唯一一次是 在贵州遵义的发病玉米植株上采集到少量冬孢子。病 菌的夏孢子生命力较短，新鲜孢子一般在30 d内失 去萌发力，并且不耐低温，无法在北方越冬存活p4】。 CIMMYT提供的研究信息也表明，多堆柄锈菌的冬 孢子不萌发，对病害的发生与传播没有作用(www maizedoctorcimmytorg)。同时，迄今也未发现多堆 柄锈菌存在转主寄主，因此推断该菌只能通过不断地 产生夏孢子完成病害侵染循环和扩散流行以及病菌自 身的生活史。国际上较早的研究也证明了这一点，1949 年开始在非洲西部地区国家(如尼日利亚等)暴发的 玉米南方锈病是从位于大西洋西部的加勒比海地区经 过风的作用、远涉3 000英里后传入的，在非洲大陆 定殖后开始引起严重的生产问题【9】。美国的研究也表 明，在美国本土上玉米南方锈病的发生也存在从南向 北逐渐扩展的流行模式，主要原因是南部地区玉米为 双季，发病后病菌通过气流逐渐向北方玉米区扩散并 引起夏末初秋田间的发病I】叭。 目前，中国除海南省三亚地区作为作物南繁基 地在10月至次年3月有大量的玉米种植外，其它地 区极少冬种玉米，即使在广东南部少数冬种玉米的 地区，在冬季也没有南方锈病的发生。在三亚，从 l1月开始至次年4月是南方锈病的发生季节，且病 害非常严重，但该地区的菌源是否是次年引起华南、 华东甚至黄淮海地区玉米南方锈病的初侵染源呢? 由于2011与2012年的菌株明显聚为2支，因此表 明玉米南方锈病病菌均无法单独在当地越冬而形成 1个完整的周年病害循环，病害的初侵染源在年度 间存在不一致性。本研究证明，冬季在海南省三亚 发生的玉米南方锈病，病原菌与其它地区的比较， 遗传相似性最低，遗传距离最远，在聚类中也仅与 云南和广西的各1个菌株(北京菌株也是来自广西 的同一菌株)聚在一起。因此，笔者推断，三亚冬 季的菌源极可能不是中国华南、华东和黄淮海地区 玉米南方锈病的初侵染源，这些地区的初侵染源更 可能来自周年可以种植玉米的菲律宾或中国台湾省 等地。研究结果还表明，福建与浙江菌株间相似性 较高，江苏、安徽、山东、河南和河北菌株间遗传 距离较近。对不同地域问种群基因流的分析也表明， 北方地区玉米南方锈病的初侵染源可能与中国南方 地区(如海南、广东、广西)病害无关。这些信息 综合表明，发生在中国不同地区的玉米南方锈病， 其初侵染源可能不同。 32影响病菌遗传变异以及群体遗传多样性的因子 寄主种类和抗病水平对专性寄生病菌具有显著的 毒力表型选择作用，但关于选择方向有不同的研究报 道。Kolmer的研究表明，来自感病小麦品种上的叶锈 病菌的毒力型一般要较来自抗病品种上的丰富【l”。中 国对小麦条锈病菌的研究表明，小麦品种对病菌的 遗传结构具有明显影响，来自抗病品种的单孢子堆 菌系遗传变异明显较来自感病品种单孢子堆菌系的 丰富【 。近年的研究也表明，寄主品种同样对病菌 的基因型能够产生影响，例如普通小麦和硬粒小麦以 及不同小麦品种对叶锈病菌的毒力表型和遗传基因型 具有同样的选择和定向影响作用13-16。麦类白粉病菌 也能够因寄主不同而发生毒力和基因结构的变异1 7】。 但也有研究认为，甘蔗品种对甘蔗锈菌遗传变异的影 响只占总变异的3，表明寄主品种问的遗传差异对 病菌遗传改变的影响作用不明显【1刖。由于对锈菌等无 法培养或较难培养的病菌进行群体遗传多样性研究时 以直接采白田间的菌株为研究样本，因此，寄主遗传 背景的不同可能会对专性寄生的锈菌菌株具有一定 DNA水平的诱导变异作用，这种对遗传的改变不仅存 在于以往人们认识到的寄主抗性对病菌毒性的表型 定向选择方面，也存在于非抗病寄主对病菌遗传结构 的基因型改变方面。寄主群体结构与病菌群体结构两 者之间的互作、变异与适应，从宏观方面解释了2 个生物群体之间的协同进化过程，但在总体上还缺乏 深入的研究。因此，在研究病菌的进化与变异时，不 仅仅要考虑环境、气候等宏观因素的作用和病菌 DNA突变、无性与有性重组【】9J等微观因素的作用， 也需要考虑寄主作为病菌生活基质的中观因素的影 4532 中国农业科学 46卷 响。此外，锈菌是一类主要通过气流运动进行远距离 传播的病菌 ， 们，在高空漂移时，来自空中的各种辐 射无疑也是其在长距离传播过程中造成DNA变异的 重要原因之一L2 。 33病菌遗传多样性研究与抗病育种 玉米南方锈病菌属于专性寄生菌，除玉米外，还 侵染蔗茅属和摩擦禾属植物。自1955年以来在玉米上 曾有许多多堆柄锈菌小种报道22-23】，但由于以往采用 的鉴别寄主中2份材料的丢失，目前的小种鉴定与研 究遇到困难。巴西采用50个玉米杂交种对采自4个地 区的60个单孢子堆菌株进行鉴定，获得了17个毒力 型【 。近年，泰国对其国内玉米上的多堆柄锈菌进行 了遗传结构研究，划分为13群，并证明病菌通过气流 作用在地区间发生了交流5】。 笔者对不同来源的72份病菌的遗传多样性研究 表明，病菌的遗传变异明显，具有一定的地区差异特 征，据此推断中国不同地区的玉米南方锈病病菌可能 在毒力表型方面存在差异，因此在华南玉米区与黄淮 夏玉米区可能需要考虑选育和推广不同的抗南方锈病 玉米品种。 4结论 中国不同地区玉米南方锈病致病菌多堆柄锈菌群 体具有较高的遗传变异。病菌无法在当地完成周年侵 染循环，各地南方锈病的初侵染源来源不同；海南三 亚冬季发生的玉米南方锈病不是中国其它地区病害的 初侵染源，广东和广西等华南地区的玉米南方锈病也 不是黄淮夏玉米区病害的初侵染源；中国大陆地区和 海南岛的玉米南方锈病初侵染源可能来自于中国大陆 以外的地区。 References 1】 王晓鸣，晋齐鸣，石洁，王作英，李晓玉米病害发生现状与推广 品种抗性对未来病害发展的影响植物病理学报，2006，36(1)： 111 Wang X M，Jin Q M，Shi J，Wang Z Y，Li XThe status ofmaize diseases and the possible effect of variety resistance on disease occurrence in the futureActa Phytopathologica Sinica，2006，36(1)： 1-11(in Chinese) 2 Melching J SCorn rust：Types，races，and destructive potential Proceedings of the 30th Annual Corn and Sourn Research Conference1975：901 l5 3 阮义理，胡务义，何万娥玉米多堆柄锈菌的生物学特性玉米科 学，2001，9(3)：82-85 Ruan Y L，Hu W He W EThe biological character ofthe causal organism of corn rust，Puccinia polysora UnderwJournal ofMaize Sciences，2001，9(3)：8285(in Chinese) 4 石洁，刘玉瑛，魏利民河北省玉米南方型锈病初侵染来源研究 河北农业科学，2002，6(4)：5-8 Shi J，L YY，WeiLMSmdy onthe soce ofcornrust pathogen (south type)in Hebei Province ，w口，ofHebei Agricultural Sciences， 2002，6(4)：5-8(in Chinese) 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