细胞工程作业总VIP

细胞工程作业 1（第一、三、五章）一、名解：1. 细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的的利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。2. 细胞全能性：每一个活细胞都包含植物生长发育所必需的全部基因，都具有再生成一个完全的有机体的潜力。 3. 愈伤组织：由脱分化的细胞经过分裂产生的无组织结构无明显极性的松散细胞团，它具有再分化成为完整植物体的潜能。4. 外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。5. 脱分化：又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程，即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。6. 原生质体：植物细胞工程中脱去全部细胞壁的细胞叫原生质体。7. 胚胎培养：指对植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。 8. 成熟胚培养：一般是指子叶期至发育成熟的胚的培养。 9. 幼胚培养：是指胚龄处于早期原胚、球形期胚、心形期胚、鱼雷期胚的培养。10. 胚乳培养：指处于细胞期的胚乳组织的离体培养，它的功能是为胚发育和种子萌发提供营养。 11. 胚珠培养：是指未受精或受精后的胚珠离体培养。 12. 子房培养：是指授粉和未授粉的子房培养。 13. 人工种子：将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮形成的类似种子的颗粒。 14. 植物脱毒：利用物理、化学或生物学方法脱除植物所感染的病毒，在无菌条件下培养不带病毒的植株，进行快速繁育无病毒种苗的技术。二、问答题：1、细胞培养有哪些主要设备及途?超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，CO2 培养箱，倒置显微镜，酶标仪、液氮罐、滤器，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪等。自动双重纯水蒸馏器和纯水仪是水处理设备，细胞培养对水的要求较高，至少是使用双蒸水，最好使用三蒸水或超纯水。超净工作台为细胞操作提供无菌环境。压力蒸汽消毒器：湿热消毒。电热干燥箱：干热消毒（玻璃器皿）（160，2h）/烘干消毒湿热物品（60，24h）。 CO2 培养箱：用于动物细胞培养，提供精确的温度，维持培养基 pH。倒置显微镜：能够从容器底部观察培养的活细胞形态。酶标仪:定量测定培养物中的 OD 值。2、如何测定细胞活力？依据的原理是什么？台盼蓝染色法：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。MTT（甲基噻唑基四唑）法：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。3、试述细胞培养的灭菌方法和各自的适用范围。物理灭菌法紫外线消毒：用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，主要应用范围是布类、橡胶制品 (如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如 Hanks 液、 PBS 等) 。过滤除菌：一是用超净台对操作空间的空气除菌；二是用滤膜对培养用液和各种不能高压灭菌的溶液（如抗生素、激素、酶液、血清的灭菌。以 022 m 滤膜除菌最为常用。火焰灭菌：用于玻璃吸管、培养瓶口的灭菌。化学消毒法70(或 75) 酒精 (卫生级) ：最常用的化学表面消毒剂 ，用于手和一些金属器械或工作台面或物体表面的消毒。05过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min 即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。抗生素抑菌在细胞培养时，在培养基中添加抗生素，抑制细菌、真菌等污染。4、试述细胞冻存的主要方法。细胞冻存分为两种：一种是低温保存：-20C 左右温度保存细胞；一种是超低温保存：在液氮（-196C ）中保存。超低温冷冻又分为：缓慢冷冻、快速冷冻、预冷冻等。缓慢冷冻法：将处于 0或其它预处理温度下材料以 1-2/min的降温速度降到-70再投入液氮中。适用于不抗寒的或含大液泡和大量水分的植物材料以及动物细胞。快速冷冻法：将材料在 0或其它预处理温度下直接放入液氮中进行冷冻。适用于脱水程度高、抗寒性强的材料如种子、花粉、冬芽、茎尖等。预冷冻法（两步法）：第一步用慢冻法降到一定温度（多以 0.5-4/min 的速度降到-40左右）并停留一段时间，第二步投入液氮中。适用于多种植物的茎尖、芽、悬浮细胞等。5、试述人工种子的制作流程。1 选取目标植物2 通过组织培养诱导形成愈伤组织3 愈伤组织转移到液体培养基中增生扩大4 由愈伤组织获得体细胞胚5 选用合适的人工胚乳包埋体细胞胚，其中含有必需的营养物质、生长因子等成分。6 包裹形成人工种皮6、植物组织培养中的调节物质有哪些？各有何作用？生长素：刺激细胞分裂和诱导根的分化。细胞分裂素：引起细胞分裂，诱导芽的形成。赤霉素：促进细胞生长。7、植物组织培养再生植株的途径有哪些？试举例说明。器官发生途径、体细胞胚发生途径、器官外植体直接发生途径、悬浮培养细胞发生途径、愈伤组织发生途径、单细胞发生途径、原生质体发生途径8、试述植物组织培养的步骤（过程）选择合适的外植体 接种在合适的培养基上培养 形成愈伤组织 诱导培养形成芽、根 进一步发育成试管苗 练 移栽进一步发育成完整植株9、植物组织培养中经常会遇到哪些问题，如何解决？（1）玻璃化现象。措施：降低培养基中细胞分裂素和生长素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮素等生长抑制物质。控制适宜的培养温度 降低容器内湿度 减少培养基中含氮化合物的用量 增加自然光照 控制继代次数（2）褐变问题选择适宜的外植体。选择适宜的培养条件。材料预处理和经常进行细胞筛选。使用抑制剂。使用吸附剂。（3）微生物污染改进外植体消毒方法。反复检查培养物。使用抗生素。10、植物脱毒主要的方法和特点是什么？如何鉴定脱毒植物？植物脱毒主要有物理、化学、和生物 3 种方法。物理方法：高温处理又称热疗法。使病毒钝化失活，繁殖力下降，失去侵染能力，而植物基本不受伤害。该方法对一些圆形病毒或者线状病毒有效。低温处理法：冷疗法，降低温度使病毒活力下降。化学方法：利用嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药品处理患病植物可以抑制植物体内病毒复制。生物方法：病毒并不会侵染植物的每一个部位，因此选择不带病毒的外植体来再生植株就可以达到去病毒的目的。鉴定再生植株后，一般应在 18 个月以内进行病毒检测，因为病毒在植物体内的潜伏期一般在 6-12 个月。常用的检测方法：直接检测法；指示植物法；电镜法抗血清检测法；分子检测技术。细胞工程作业 2（第六、七、八章）一、名词解释：1. PGD 试管婴儿：通过种植前遗传学诊断（PGD）技术培育出的试管婴儿将被称为第三代试管婴儿。2. 胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子进行的工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。3. 超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，利用手术的取出卵母细胞。目的是最大限度地利用母畜的生殖能力（牛超数排出 5-10 个卵母细胞） 4. 胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术。 5. 胚胎分割：借助显微操作技术或徒手操作方法，切割早期胚胎成 2、4 等多等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔后代的技术。 6. 胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。 7. 试管动物：将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。 8. 体外受精：哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。 9. 克隆动物：用特定发育阶段的核受体体外构建重组胚，通过胚胎移植到受体完成发育出生的动物。包括胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物。10. 核体：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。 11. 胞质体：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 12. 微细胞：又可被称为微核体，是指含有一条或几条染色体（即只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。 13. 细胞质工程：研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技术。 14. 胞质杂种：将两种来源不同的核外遗传物质（细胞器）与一个特定的核组合在一起得到的细胞。 15. 细胞融合：是指用人工的方法使二个或二个以上的细胞或原生质体(除去细胞壁的细胞) 融合成一个细胞的技术。16. 体细胞杂交：不同来源的体细胞融合并使之分化再生形成新品种的技术。 17. 染色体工程：按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的目的。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。 18. 多倍体：细胞中含有三个或更多染色体组的个体。 19. 单倍体：细胞中含有正常体细胞的一半染色体数。 20. 温度休克法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵裂)的方法。 21. 植物的离体受精：指在体外无菌条件下培养未受精的子房、胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠完成受精的技术。二、问答题：1 试管动物培育的步骤是什么?精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养；体外受精； 重组胚激活与体外培养；胚胎移植； 体内发育、出生。2 核移植动物与体外受精动物相比有怎样的优点和缺点？核移植优点：能克服远缘杂交的不亲和性,有目的地培育优良品种 .动物体细胞克隆,可用于保存濒危物种、保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等缺点：技术复杂,难度大；它将对生物多样性提出挑战 ,有性繁殖是形成生物多样性的重要基础,而“克隆动物”则会导致生物品系减少 ,个体生存能力下降.3 细胞核移植克隆动物的技术路线。核供体细胞的获得与取核 受体细胞的准备与去核 细胞核移植 重组胚的激活与培养 胚胎移植 核移植后代鉴定。4 如何分离 X 精子和 Y 精子？在胚胎移植前进行性别鉴定的方法和依据是什么？免疫学分离法： Y 精子存在 H-Y 抗原，利用 H-Y 抗体检测精子质膜上是否存在 H-Y 抗原。离心分离法：X 精子 DNA 含量略大于 Y 精子，因此 X 精子密度较 Y 精子略大。电泳分离法： Y 精子负电荷略步小于 X 精子，利用表面电荷差异采用电泳进行分离。流式细胞仪分离法：根据 X、Y 精子上 DNA 含量的微小差别分离。化学药品处理法：Y 精子有嗜碱性，而 X 精子有嗜酸性。胚胎移植前性别鉴定细胞生物学方法：通过判定胚胎细胞性染色体是还是来鉴定胚胎的性别。分子生物学方法：根据 Y 染色体上的 SRY 基因的有无进行鉴别。可用DNA 探针法和 PCR 扩增法。生化分析法胚胎 H-Y 抗原检测法 相关酶分析法：通过测定与 X 染色体相关的酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）活性来达到鉴别胚胎性别的目的 5、何谓细胞重组？细胞重组的方式有哪些？细胞重组又叫细胞拆合，指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。细胞重组的方式 （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。（3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。其中最后一种是非常重要的细胞重组技术。6、试述细胞融合的方法和各自的特点。1、生物法有仙台病毒法等。各种病毒都具有凝集细胞的能力。仙台病毒除有凝集细胞的能力外，还具有促使凝集的细胞发生融合的能力。缺点：融合随机，融合率低。要提前培养病毒，并且灭活后才能使用，一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用。2、化学法最常用的方法：PEG 结合高 Ca2+-高 pH 诱导法诱导优点：融合成本低，产生异核率高，不受物种限制，融合率较高缺点：过程繁琐，可能对细胞有毒害。3、物理法主要采用电融合诱导法。优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程；免去 PEG 诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。7、细胞融合后如何筛选？融合后细胞的种类未融合的细胞同核体同源原生质体的融合体。 异核体非同源原生质体的融合体。 多核体含有双亲不同比例核物质的融合体。 1、选择性培养基筛选法：利用原生质体或细胞对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法，是常用的筛选方法 抗性互补筛选系统:利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞的方法营养互补选择系统：利用两种亲本细胞营养互补作用原理筛选杂种细胞的方法温度敏感突变型融合细胞的筛选：在低温和高温下均能生长的为杂种细胞2、物理特性筛选法：利用亲本细胞与杂种细胞的物理特性的差异进行选择3、荧光素标记法：利用双亲细胞与杂种细胞不同的荧光标志用荧光显微镜或流式细胞仪进行选择。8、试述体细胞杂交的过程（步骤）：亲本选择；原生质体制备；原生质体融合；融合细胞（杂种细胞）筛选；融合细胞（杂种细胞）的培养（细胞壁再生、分裂形成细胞团、愈伤组织）由愈伤组织再生植株；杂种植物鉴定。9、如何进行体细胞杂交后的鉴定?形态学鉴定：根据茎、叶、花等组织的形态、颜色来鉴别杂种。两亲本的亲源关系较远时，杂种植物的形态倾向于亲本之一，但存在差异。细胞学鉴定：原生质体融合的亲本材料一般为二倍体，杂种细胞的染色体应该为双二倍体。如果亲本的亲源关系较远，染色体差异会较大；同时，杂种细胞中一亲本的染色体可能会受到另外一亲本的排斥，可能会产生大量非整倍体。因此可以从杂种植物染色体的形态、大小和数目上鉴定是否是杂种植物。同工酶（isoenzyme）鉴定：杂种植物的同工酶谱是双亲本酶谱的总和，表现为条带增多、酶带颜色加深、宽度加大，有时还出现两亲本都不具有的新谱带或者丢失部分亲本酶带。DNA 分子标记鉴定：是在分子水平对亲本和杂种植物遗传性状差异进行鉴定，能正确揭示出生物个体间核苷酸序列的差异。10、植物和动物多倍体育种方法有哪些？如何获得异源多倍体植物？植物多倍体育种方法物理因素诱导：温度骤变、机械创伤、电离和非电离辐射、离心力等化学因素诱导：秋水仙素是至今发现的最有效、使用最为广泛的染色体加倍诱导剂。 生物方法生物学方法主要指杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交繁殖多