浅谈荧光分析法的特点及在环境分析中的应用

荧光分析法的特点及在环境分析中的应用摘 要：论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点，以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用，测定范围和发展情况。关键词：荧光分析；环境分析；应用1.引言环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质，有很多还具有时间性和空间性，因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向 1。分子荧光分析具有检测限低，灵敏度高，选择性好，取样量少，方法简捷快速等特点，是一种重要的光谱化学分析手段，其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位 2。因此，在对环境的分析中，荧光分析法应用非常广泛，从天然水、饮用水到废水、污水；从土壤、大气到动植物；从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官，涉及到的样品和应用范围几乎无所不有 3。2.荧光分析法的原理和特点2.1.荧光分析法2.1.1 荧光及荧光分析荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态，即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10 秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失。荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852 年 G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测量则始于本世纪 60 年代。2.1.2 荧光激发光谱和发射光谱荧光是一种光致发光现象，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱。如果使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的测定波长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射光谱。激发波长反映了在某一固定的发射波长下所测得的荧光强度对激发波长的依赖关系；发射光谱反映了在某一固定的激发波长下所测量的荧光的波长分布。激发光谱和发射光谱可用以鉴别荧光物质，并可作为进行荧光测定时选择合适的激发波长和测定波长的依据。2.1.3 荧光分析法的原理大多数分子在室温时均处在电子基态的最低振动能级，当物质分子吸收了与它所具有的特征频率相一致的光子时，由原来的能级跃迁至第一电子激发态或第二电子激发态中各个不同振动能级。其后，大多数分子常迅速降落至第一电子激发态的最低振动 能级，在这一过程中它们和周围的同类分子或其他分子撞击而消耗了能量，因而不发射光。分子在第一电子激发态的最低振动能级停留约 9-10 秒之后,直接下降至电子基态的各个不同振动能级，此时以光的形式释放出多余的能量，所发生的光即是荧光。某些荧光物质分子在降落到第一电子激发态的最低振动能级后，通过另一次无辐射跃迁降落至亚稳的三重线态，又受到热激活作用再回到第一电子激发态的各个振动能级，最后由第一电子激发态的最低振动能级降落至电子基态而发出荧光。这种荧光因受激发光至发生荧光的时间较长,故称为迟滞荧光。 产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光效率。所谓荧光效率是荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。 2.2. 荧光分析法的类型 42.2.1 荧光生成法在荧光生成的测定中,新有机试剂合成依然比较活跃,并向灵敏度高、方便实用方向发展。如 8-氨基喹啉类、腙类等荧光试剂。但具有特异选择性及用于特定目的的新试剂依然不多见。2.2.2 荧光猝灭法基于金属离子对荧光试剂或荧光配合物的荧光猝灭作用的检测方法相对较多。一般说来,荧光猝灭法的灵敏度比直接荧光测定的方法要高,但其线性范围和选择性通常不如荧光生成的好，赵保卫等人研究了 Hg 离子对 2-(2-羟基苯基)苯并咪唑的荧光具有熄灭作用,体系荧光熄灭度与 Hg 量呈线性关系,据此建立了测定痕量 Hg 的高灵敏方法 5。2.2.3 催化荧光法催化荧光动力学分析法是荧光动力学分析法的重要方向之一,它是以催化反应为基础来测定物质含量的方法。由于测量对象非被测物本身,而是经“化学放大”了的其它物质,因此灵敏度极高,检测限可达 ng 级或 pg 级。在生命相关的重金属的分子荧光法测定中,相对荧光猝灭和生成,催化荧光法所占的比例依然较小,因此仍有广阔的发展前景。因此寻求新颖,高灵敏的反应体系尚需要进一步的探索,且依然具有一定的理论和实践的意义。3 荧光分析法的特点3.1 荧光定量分析的各种条件 6在荧光定量分析中，必须根据试样的种类、待测成分的浓度、共存物质的种类及其浓度选择适当的荧光反应类型和操作条件，选择准则一般是荧光强度高、影响荧光强度的因素少、分析的精密度高等。为了确定荧光分析的最佳工作条件，应考察 pH 值、温度、试剂用量、溶剂种类与用量、荧光化合物的稳定性等因素的影响及其消除方法。试剂的纯度也是不可忽视的因素，此外还必须准确测定待测组分的激发和发射光谱。2.3.1 溶剂同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和荧光强度都可能有显著的不同。如果溶剂和荧光物质之间形成了化合物或溶剂使荧光物质的电离状态改变，则荧光峰的波长和荧光强度都会发生很大的变化。从应用的角度来讲，对于溶剂主要考虑三个因素：溶剂的选择要适当；溶剂应有足够的纯度；溶剂特别是混合溶剂，有时往往更有利于提高荧光物质的荧光强度。2.3.2 试剂荧光分析所用的试剂纯度是十分重要的，即使是特级试剂，其中极少量的杂质有时也会与荧光分子探针反应，并产生荧光或猝灭荧光而造成错误的分析结果；试剂长期放置有时会分解，溶解在试剂溶液中的氧具有猝灭荧光作用，从而影响荧光光谱的形状和荧光强度。因此，实际工作中往往需要针对各种试剂的特征，认真研究它们的保存条件。实验中各种试剂一般都需要提纯，要注意做空白试验，配制水溶液时必须使用去离子水或二次蒸馏水。2.3.3 pH 值溶液的 pH 值对荧光物质的荧光光谱以及荧光强度具有很大影响，进行定量分析时，必须选择最佳 pH 范围。荧光物质为弱碱或弱酸时，溶液的 pH 值的改变，会使其电离状态发生变化，从而影响其荧光光谱和荧光强度。对于金属离子与有机试剂形成的荧光络合物，溶液的 pH 值改变还会影响到络合物组成的改变，从而影响到它们的荧光性质。2.3.4 温度一般来说，溶液随温度降低而荧光效率升高、荧光强度增大，这是由于温度降低时，介质的粘度增大，荧光物质分子与溶剂分子的碰撞随之减少的缘故。由于激发光源产生的热量，容易导致温度的变化，有时一分钟可以上升810，因此，在精确测定时应备有恒温池架，以恒定温度。实际工作中，一般控制在 2025范围内。需要注意的是，有时有些反应速度较慢，往往要加热才能使反应完全。2.3.5.荧光物质的稳定性在激发光的直接照射下，有些荧光物质不稳定，当连续地用激发光照射时，因荧光物质的光分解或聚合，会使荧光强度减弱。对于这些荧光强度不太稳定的成分应尽快测定，不要经常开启光闸，使光分解现象尽量减少。生成荧光物质的反应速度和荧光物质的稳定性及其化学结构有关，不同结构之间的差别较大。在定量测定之前，必须认真考察荧光物质的稳定性。2.3.6.共存物质的影响在定量分析中，共存物质的干扰主要有以下几个方面：共存物的荧光猝灭作用，共存物质产生背景荧光，共存物质与荧光物质发生反应、共存物质吸收激发光或荧光使荧光强度减弱等。遇到这些情况必须采取相应的措施，消除其干扰。共存物质的存在，会影响荧光分析的定量测定，实际工作中应认真分析其影响原因，不可轻易放过。有时往往因此发现新类型的荧光反应。3.2 荧光分析法的优点灵敏度：在微量物质的各种分析方法中，应用最广泛的至今仍然首推比色法和分光光度法。荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高 23 个数量级。选择性：荧光分析的另一个优点是选择性高。这主要是指有机化合物的分析而言。发荧光的物质彼此之间在激发波长和发射波长方面可能有所差异，因而通过选择适当的激发波长和荧光测定波长，便可达到选择性测定的目的。此外，荧光的特性参数比较多，除量子产率、激发和发射波长之外，还有荧光寿命、荧光偏振等。因此，还可以通过同步扫描，导数光谱、三维光谱，时间分辨和相分辨等一些荧光测定的新技术以进一步提高测定的选择性。除灵敏度高和选择性好之外，动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂等等，也是荧光分析的优点。当然，由于不少物质本身不发荧光，不能进行直接的荧光测定，从而妨碍了荧光分析应用范围的扩展。因此，对于荧光的产生与化合物结构的关系还需要进行更深入的研究，以便合成为数更多的灵敏度高选择性好的新荧光试剂，使荧光分析的应用范围进一步扩大。4 荧光分析法在环境中的应用4.1 荧光分析法在环境分析中的测定范围 在环境监测中应用荧光分析法，主要是用于对单项指标的测定。在无机物的荧光分析中,经常用直接荧光法进行测定的元素主要有铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。常采用荧光猝灭法测定的元素有氟、硫、铁、银、钴、镍、铜、钼、钨等。采用动力学荧光法进行测定的有铜、铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铝、钛、钒、锰、铒、过氧化氢和 CN-离子等。日本、美国等除了采用荧光分析法进行单项指标的测定外，还将荧光分析法应用于环境有机物综合指标的测定。在有机物的荧光分析中，脂肪族有机化合物本身会发荧光的不多，但有许多都能和某种有机试剂反应，其产物具有荧光特性，可进行荧光分析。例如,醇、肼、醛、酮、有机酸、糖类等等。芳香族有机化合物因具有共轭的不饱和体系，很多都能发生荧光，如：多环芳烃、芳族硝基化合物、芳族羰基化合物、酚和醌、杂环化合物、油 7分等。而用荧光分析进行有机物综合指标的测定，还未见相关的报道。环境污染以有机污染为主，环境中有机物种类繁多，组成复杂，化学稳定性差，且含量较低，有的只是痕量浓度，因此除了针对需要测定单项指标外，还必须测定综合指标来反应环境中有机物的相对含量 8。4.2 荧光分析法在水质分析中应用 城市污水主要包括生活污水、工业废水和一部分城市地表径流。传统表征污水的污染程度一般采用化学需氧量 COD（Chemical Oxygen Demand ） 、生化需氧量 BOD5（Biochemical Oxygen Demand ）这两项指标，由于该项指标测定周期长，过程繁杂，因而不能及时监测水质的变化 9。此外 COD 的测试受加入氧化剂的种类和浓度、反应溶液的 pH 值、反应温度和时间等条件的影响很大10。BOD5 的测定则更加烦琐，需历时 5 天。特别是从监测的灵敏度来比较，荧光分析法具有很高的灵敏度，其检测限可达 10-1211。同时，它又具有荧光寿命、荧光量子产率、激发波长、发射波长等多个参数，因而又有比较好的选择性，荧光分析法有高至万亿分之几的 12，而 COD、BOD5 一般都用 mg/L 的浓度来表示，荧光分析法取样量少，无需任何化学试剂，具有较高的灵敏度、测试快速、简便，从而可以更快、更准地把握时刻变。4.3 荧光分析法对环境中重金属测定的应用重金属是一类具有潜在危害的重要污染物，如 Hg，Pb，Cd，Cr，Zn，Cu，Co，Ni，Sn，Ba，Ge 等，从毒性这一角度，通常把 As，Be，Li，Al 也包括在内，目前，最引人注意的是 Hg，Cr，Cd，Pb。重金属污染的特点是：(1)含量很低时就能引起环境污染。(2)重金属不能被微生物分解，相反，有些重金属有可能在微生物作用下转化为毒性更强的金属一有机化合物。(3)地表水的重金属可以通过生物的食物链富集，而达到相当高的浓度。(4)重金属进入人体后能够和生理高分子物质(如蛋白质、酶等)发生强烈的相互作用使它们失去活性，也可能累积在人体的某些器官中，造成慢性累积性中毒。自从 20 世纪 50 年代在日本出现水俣病和骨痛病，并且查明是由于汞污染和镉污染引起的死亡公害病以后，重金属的环境污染问题受到人们极大的关注。从而痕量、超痕量水平重金属离子的分析测定技术越来越受到科研工作者的关注。所以，建立这些重金属的痕量、超痕量分析检测技术具有十分重大的意义。重金属对人体健康的影响已经成为一个重要的公共卫生问题当人体中重金属元素达到一定浓度时，会使人体器官、组织发生病变比如过量的硒可引起硒中毒，使人患脱发、脱甲、偏瘫 13 高浓度的铅可使免疫受到削弱，使生育力遭到破坏 14 中药材的重金属含量直是影响中药出口的重要因素，国际进口中药材对重金属均有明确规定因此，建立一种快速、准确的分析方法是十分必要的原子荧光分析法是一种优良的痕量分析技术以其快速、灵敏、简便等特点，已广泛用于环境、生物、冶金、地矿、石油 15、食品、医疗卫生等很多领域中的多元素分析，如陈剑侠等人采用铁氰化钾-草酸的体系用氢化物原子荧光法直接测定海水中痕量的铅 16, 罗晓芳等人采用氢化物原子荧光测定法测定空气中铜 17，刘艳娟等人采用原子荧光光谱法测定土壤中的锗 18等等。近年来原子荧光领域的研究与应用十分活跃 19-22 ，对实际工作取得了较好的效果。5 荧光分析法研究发展趋势当今,由于生命科学、环境科学、材料科学、宇宙科学等发展的突飞猛进,化学分析越来越多地要求做痕量、超痕量分析,甚至单原子、分子的检测也提到了日程上。因此,利用更灵敏的检测手段和更多的物理参数来加以分辨的,具有高灵敏度和高选择性的荧光新技术迅速发展起来。例如流动注射荧光法、偏振荧光法、导数荧光法、同步荧光法、蒸气发生一原子荧光光谱法 23、时间分辨荧光法、相分辨荧光法和激光荧光法等,这些方法在检测生命相关重金属元素上也得到了广泛的应用。流动注射技术(FIA)自从 20 世纪 70 年代创立以来,由于具有高效率、高精度、低消耗、设备简单、有广泛的适应性等特点,在分析领域已获得了广泛的应用。FIA 技术与荧光检测联用,FIA 为试液和荧光检测器之间的界面,除带来一般流动注射分析的优越性之外,FIA 统的密闭性显著地改善了荧光分析的条件(如防止氧的荧光猝灭作用),对利用反应动力学进行定量的荧光分析十分有用。荧光分子探针是近期发展起来的新技术。首先荧光分析方法是基于荧光光谱和荧光强度改变建立起来的分子水平上的识别方法。荧光分子探针(fluorescent molecular probe)、荧光分子开关(fluorescent molecular switch)和荧光分子传感器(fluorescent molecular sensor)是在荧光分子识别(fluorescent molecular recognition)中经常使用的概念。荧光分子探针是其中内涵最广的一个概念，一般说来，凡是在一定体系内，当某种物质或体系的某一物理性质发生变化时，该分子的荧光信号能发生相应的改变，这种分子就可称为某一物质或物理性质的荧光分子探针 24；荧光分子开关是指在识别过程中荧光信号有明显强弱变化的荧光分子探针；荧光分子传感器 25是指在识别过程中分子荧光信号能够快速、可逆响应的荧光分子探针。所谓分子识别是指分子之间(主体与客体或称之为受体与底物)选择性地结合并产生某种特定功能的过程。单纯的结合不是识别，识别是有目标的结合，它是通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程。结合形成的识别体系的稳定性和选择性，是由形成过程中的能量和信息量来表征的。荧光分子传感器可以分为：pH 荧光化学传感器，它是较早产生的荧光化学传感器之一,如 1-羟基-3，6，8-三磺酸基芘 26、荧蒽、酚红 27、7-羟基-3-羧基香豆素 28、4-甲基-7-羟基香豆素及四溴荧光素等，常用作 pH 荧光光纤传感器的荧光试剂。金属离子荧光化学传感器，常用的重金属离子荧光化学传感器中的敏感载体多为大环化合物，如卟啉化合物 29、杯芳烃、冠醚等。此外还有，有机污染物荧光化学传感器 30。药物荧光化学传感器。荧光湿度传感器。荧光气体传感器 31。6 荧光分析法的展望荧光分析化学作为一种可以对环境监测对象，进行快速、准确、实时在线检测的新方法,其灵敏度高、选择性好、操作简便。但是处在不断发展阶段的荧光分析也面临着一些问题,制约着荧光分析的广泛应用，例如:如何避免环境光的干扰；有些指示剂易光照分解从而影响其荧光寿命；检测范围相对较窄；与检测对象的响应机理的进一步完善等。今后的研究中应注意以下几点:(1)利用有机化学的方法和手段,开发性能优良的可用于环境分析监测的荧光分析化学研究系统。(2)开发新的荧光分析联用技术。 (3)环境分析与监测等实际分析工作经常需要实时同步获得多方面的信息 32。这就需要将现有的荧光分析技术,与光学、电子等多方面的技术有机结合起来,构造成集成便携式的综合测量体系。这将是未来荧光分析方法发展的趋势。参考文献：l许金钩,王尊本.荧光分析法M.第三版,北京:科学出版社,20062吴性良,朱万森,马林.分析化学原理M.北京:化学化工出版社,20043 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