山茱萸酒制的炮制工艺及质量标准研究

山茱萸酒制的炮制工艺及质量标准研究一、立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，并附有主要参考文献）（一）研究的目的和意义1中药炮制是中医用药一大特点，是提高疗效的重要环节。中药饮片炮制机理研究是中药炮制学科的一项重要任务其研究成果将促进中药炮制学科的发展。明确饮片的炮制机理，可知道饮片的临床应用。为中药饮片在临床上的准确使用，更大程度地保证其有效性和安全性甚至发现新用途提供科学依据。2. 本品为山茱萸科植物山茱萸 Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。其味酸、涩，性微温。归肝、肾经。具有补益肝肾、涩精固脱的功效。山茱萸主要含有挥发性成分、环烯醚萜苷、有机酸、鞣质等化学成分。用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等方面。山茱萸生品敛阴止汗力强，多用于自汗，盗汗，遗精，遗尿。如治肾虚尿多失禁的山茱萸散（圣惠方 ）。蒸制山茱萸后补肾涩精、固精缩尿力胜，酒制山茱萸后借酒力温通，助药势，降低其酸性，滋补作用强于清蒸品，多用于头目眩晕，腰部冷痛，阳痿早泄，尿频遗尿。如治肾虚遗精的六味地黄丸（药证 ） ；治肝阳上亢，头目眩晕的草还丹（扶寿精方 ） 。3. 我国历史上对山茱萸炮制的主要方法是“去核” ， “酒蒸”目前对山茱萸炮制方法仍有: 去核, 酒蒸山茱萸、蒸山茱萸, 醋山茱萸, 盐山茱萸等, 其中尤以酒山茱萸为常用, 但由于各地用药习惯不同, 使用的炮制品也有所侧重。辽宁、重庆多用酒山茱萸, 蜜山茱萸；西安、天津、北京、山东多用酒焙、酒蒸；湖北多用醋蒸。2010 年版中国药典（一部） 及各省市的炮制规范, 收载的方法多为去核 、酒炖 、酒蒸 。炖制或蒸制时间均没有明确规定，只是要求“炖或蒸至酒被吸尽， 色变黑润” 。对于此种炮制时间的不明确，我们将酒制山茱萸的最宜时间作为一个研究方向，通过正交试验优选酒制山茱萸炮制工艺参数。且在酒制过程中，由于酒渗透作用引起药物化学成分及药理作用改变，故需对其炮制机理进行研究，从而制定最佳炮制工艺，逐步建立现代化的山茱萸饮片的质量标准。4. 药理研究表明，山茱萸具有调节免疫功能，改善肾阴虚证，抗肝损伤，抗炎，抗菌，降血糖等作用。然而研究酒制前后山茱萸中马钱苷、莫诺苷、没食子酸以及 5 羟甲基糠醛含量的变化并不能真正阐明山茱萸的炮制机理。因此在今后的研究中，我们可以采用血液药化 药动 药效结合方法对山茱萸酒制的机理进行深入研究。开展山茱萸体内有效成分的分析，弄清山茱萸酒制后血中有效成分的变化，则可确定山茱萸经酒制后是否有新有效成分进入体内而增强补益肝肾的作用。马钱素、莫诺甙等环烯醚萜甙类化合物是山茱萸中主要的水溶性成分, 生物活性很强。山茱萸不同成分的免疫药理作用不同, 总甙是其主要免疫抑制成分，我们认为有必要加强对药材中这一类成分的含量控制, 以保证中药山茱萸及其制剂的含量控制, 以保证中药山茱萸及其制剂的质量。马钱素在山茱萸中含量较高，为其总甙的主要成分之一，因此对山茱萸酒制前后马钱素的含量控制可以作为山茱萸质量评价的一个重要指标；对加强中药山茱萸的标准化研究具有重要意义。且在此以前的研究中，山茱萸的含量测定多以熊果酸为指标，而以水煎提取的制剂而言，以马钱素作为含量测定则更合理。（二）有关山茱萸炮制方法的古代文献历代医方本草关于其功用和炮制方法的记载很多，为系统研究山茱萸的炮制工艺和原理，考证了其炮制的历史沿革、传统理论及临床应用，现介绍如下。山茱萸最早的炮制方法，首见汉代金匮玉函经记载有“不咀”是有关山茱萸加工较早的记载。南北朝刘宋时代雷在其雷公炮炙论中提出“凡欲使山茱萸，须去内核，每修事，去核了，1 斤取内皮用，只称成 4 两已夹，缓火敖之方用。能壮元气，秘精，核能滑精” ，其去核方法时至今日乃沿袭此法。唐代新修本草载：“九月、十月采实阴干” ， 千金方则又提出“多打碎”用的要求。宋代山茱萸的加工炮制方法在沿用去核方法的基础上，提出了用不同辅料炮制山茱萸，宋代重修政和经史证类备用本草载：“雷公云：使山茱萸，须去内核，每修事，去核了，1 斤取肉皮用，只称 4 两已来，缓火熬之，方用，秘精，核能滑精” 。 圣济总录载：“山茱萸酒浸取肉焙” ，另有“山茱萸打破炒，去核焙干、麸炒、酒拌等制法” 。 苏沈良方载：“炒” ， 女科百问又提出：“炮”的炮制方法。元代、明代在对其炮制程度提出了进一步要求，如元代活幼心书中有：“酒浸润，蒸透”去核取皮的记载。明代补增图经节要本草歌括中载：“去核捶碎，焙感” 。 炮炙全书载：“酒润去核” 。 药性会元载：“用温水泡一须，取肉去核，每斤只去 4 两” 。缪希雍炮炙大法载：“酒拌炒锅上蒸，去核了，1 斤，取肉皮用，只称成 4 两已夹，凡蒸药用柳木甑，去水八九寸，水不泛上余悉准此” 。清代本草崇原载：“九月、十月采实，阴干去核用肉” 。 本草述载：“酒拌润去核取皮，酒蒸一炷香，雄羊油炙，盐炒” 。 良朋汇集中载有：“酒浸一夜蒸焙干” 。增广验方新编载蒸。 ， 本草述还增加了“盐炒”方法。由此可见, 我国历史上对山茱萸炮制的主要方法是去核 、酒蒸 。目前对山茱萸炮制方法仍有: 去核 , 酒蒸山茱萸、蒸山茱萸, 醋山茱萸, 盐山茱萸等, 其中尤以酒山茱萸为常用。现代炮制方法山茱萸历代炮制有去核、酒炖、酒蒸等方法，其中以酒山茱萸为常用，但由于各地用药习惯不同，使用的炮制品也有所侧重。现代各地常用的炮制方法有酒山茱萸、蜜山茱萸（辽宁，重庆） ；酒焙、酒蒸（西安，天津，北京，山东） ；醋蒸（湖北） ；以及盐山茱萸等1。现版药典收载的有山萸肉、酒萸肉。酒制山茱萸的作用：目前,对于山茱萸酒制作用， 一般认为蒸制后补肾固精、缩尿之功增强，酒制后借酒力温通，助药势， 降低其酸性，滋补作用强于清蒸品。目前 2010 版药典已经不收载清蒸品。有报道认为山茱萸不同方法炮制后熊果酸含量发生变化；用 HPLC 法测定山茱萸炮制前后没食子酸的溶出及煎出量。结果表明: 生品中没食子酸溶出量明显低于炮制品, 炮制辅料对溶出及煎出量影响不大。认为炮制 ( 蒸) 与煎煮均可使山茱萸鞣质水解, 各样品没食子酸测的量无明显差异。但山茱萸其他有效成分炮制前后变化如何尚待进一步研究1。2010 年版中国药典（一部） 所收载的山萸肉，在其炮制项下规定：“除去杂质和残留果核” ，酒制品则依照 2010 年版中国药典（一部） 附录的蒸法或炖法进行炮制。用正交试验设计进行山茱萸酒制工艺参数筛选的试验，结合化学成分的测定和药理实验结果，得到了山茱萸最佳酒制工艺条件，以酒的用量 25%，闷润时间 2h，蒸制时间 4h 为最佳2。二、研究现状1. 山茱萸的炮制方法（1）山萸肉：除去杂质和残留果核。（2）酒萸肉：取净山萸肉，加入黄酒拌匀、润透，置适宜的蒸制容器内，用蒸汽加热蒸至酒吸尽，取出，干燥；或取净山萸肉，加入黄酒拌匀、润透，置适宜的容器内，密闭，隔水炖至酒吸尽，取出，干燥。每 100kg 山茱萸肉，用黄酒 20kg3。2. 山茱萸炮制初探化学成分山茱萸的化学成分以环烯醚苷类为主：化合物有马钱素（番木鳖苷，loganin） 、莫诺苷（莫罗忍冬苷，morroniside） 、獐牙菜苷（当药苷， sweroside） 、獐芽菜苦苷（当药苦苷， swertiamarin） 、马鞭草苷（山茱萸苷，verbenalin） 、7氧甲基莫诺苷（ 7Omethyl morroniside） 、7脱氢马钱苷（ 7 dehydrologanin） 、脱水莫诺苷元（dehydromorroniaglycone） 、7 乙氧基莫诺苷、山茱萸新苷（cornuside 一种新的双环裂烯醚萜苷类化合物）等。五环三萜酸及其酯类主要有 2羟基熊果酸、齐墩果酸( 土当归酸， oleanolic acid) 、熊果酸( 乌索酸，ursolic acid)等。山茱萸中的鞣质类有梾木鞣质 A、B、C、D、E、F、G( cornuslinA、B、C、D、E、F、G) 、喜树鞣质 A、B( camptothin A、B) 、水扬梅素 D( gemin D) 、2，3 二 氧 没食子酰 D 葡萄糖、1，2，3 三 氧 没食子酰 D 葡萄糖、1，2，3，6 四 氧 没食子酰 D 葡萄糖、特里马里( 新哨纳草鞣素， tellmagrandin) 、特里马里( 丁子芽鞣素， tellmagrandin) 、异诃子素 ( isoterehebin) 、双没食子酰景天庚酮糖苷( 1，7 di O galloyl O sedoheptulose) 、单没食子酰景天庚酮糖苷( sedoheptulose gallate) 等。现已明确的山茱萸多糖成分主要有 PFCC( 木糖和葡萄糖组成)、PFCA( 鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成)、SZYP 2( 鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成)、Co 4( 葡萄糖、木糖、半乳糖组成)。山茱萸中还含有其它化学成分，如有机酸及其酯类，主要有 3，5 一二羟基苯甲酸、苹果酸、酒石酸等、挥发油、dimethyltetrahydrofuran 2，5 dicarboxylate、 谷甾醇、5，5 二甲基糠醛醚、5 羟甲基糠醛、磷脂酰胆碱、没食子酸( gallic acid) 等4。3. 药理作用1.对免疫系统的影响山茱萸生品和制品多糖均可提高免疫低下小鼠的碳粒廓清指数 K 和吞噬指数 ，增加血清 HC50 值，明显改善免疫低下小鼠的脾淋巴细胞增殖反应，且制品多糖的作用显著优于生品多糖。山茱萸生品多糖和制品多糖对免疫低下小鼠的非特异性免疫、体液免疫以及细胞免疫功能均有明显促进作用，且山茱萸经酒蒸制后，其多糖的药效显著增强。研究发现山茱萸多糖有较好免兴奋作用，可显著提高环磷酰胺致免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，促进免疫抑制小鼠溶血素、溶血斑的形成和淋巴细胞转化5。2. 抗炎作用山茱萸水煎剂能抑制醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性的增高，大鼠棉球肉芽组织的增生，二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀以及蛋清引起的大鼠足垫肿胀，并能降低大鼠肾上腺内抗坏血酸的含量，证实了该药的抗炎效果。研究发现山茱萸总苷对类风湿关节炎有明显的防治作用，特异性抑制免疫大鼠抗 C抗体的产生、腹股沟淋巴结 Th1 型细胞因子 IFN2 的分泌及细胞增殖6。3抗菌作用以无水乙醇对山茱萸果肉进行浸提，得到了山茱萸提取液。用山茱萸提取液对几种常见的食品微生物进行抑菌活性的测定。结果表明，山茱萸提取液对细菌和部分酵母的抑菌效果显著。4. 降血糖作用山茱萸有治疗糖尿病的功效。山茱英醇提取物不仅对肾上腺素或四氧嘧啶诱发的糖尿病大鼠有明显的降血糖作用，而且对链脉佐菌素诱发的糖尿病大鼠也有降血糖作用，但对正常大鼠的血糖无明显作用。山茱萸降血糖作用的有效成分是熊果酸和齐墩果酸。5其它作用：包括抗心律失常；抗氧化及抗衰老作用；抗休克等作用。4. 临床作用近年来不少临床报道指出, 山茱萸在治疗心血管系统疾病, 抗癌, 防治艾滋病, 治疗糖尿病及增强免疫功能方面, 都有相当疗效, 还有升高白细胞, 减轻放疗与化疗副反应等作用, 因此山茱萸的应用将越来越广泛。但是, 尚未见到临床对于山茱萸生品和酒制品的适应症、治疗效果等方面的研究报道1。三、研究内容（一）研究内容概括1. 选择酒炖山茱萸正交实验的各因素各水平以山茱萸的传统炮制工艺并结合查阅文献选择出以莫诺苷和马钱素含量作为评价指标，采用正交实验，选择“黄酒的用量” 、 “闷润时间” 、 “蒸制时间”作为考察因素，每种因素选择 3 个水平，对 9 种酒炖品的炮制工艺进行优选。2. 提取分离（1）药材、饮片的采购及基原鉴定，参照 2010 版中国药典及中药饮片炮制规范的要求，炮制品。（2 ）制备水提物、醇提物，在药理活性成分的跟踪指导下，系统分离活性部位及活性成分，并进行结构鉴定，确定山茱萸的活性部位和活性成分。（3）在所选各因素各水平下制备出各种炮制品，制备水浸出物、醇浸出物。取各炮制品粉末 10g 精密称定， 采用高效液相色谱法， 测定各样品中马钱素和莫诺苷含量，测定水浸出物、醇浸出物、莫诺苷和马钱素含量并进行比较。3. 测定各炮制品以及生品对肾阴虚模型小鼠的影响，探讨山茱萸炮制前后对阴虚模型小鼠的滋阴补肾作用影响，以负重游泳时间、耐缺氧时间、血清超氧化物岐化酶( SOD)活力、丙二醛(MDA)含量作为考察指标7。4. 确定最佳炮制工艺以及质量标准（二）研究目标1.明确山茱萸炮制前后化学成分（熊果酸、马钱素、莫诺苷）的变化规律。2.初步探索影响山茱萸滋阴补肾作用的主要物质基础。3.确定山茱萸酒制的最佳工艺及质量标准。（三）拟解决的关键问题1.确定山茱萸滋阴补肾作用的主要活性部位和成分。2.山茱萸炮制前后化学成分变化和药效相关性研究。四、 研究方案和技术路线1.制备（1）炮制品的制备：根据文献报道等确定正交实验的各因素与水平后，称取适量的山茱萸饮片依次根据所选炮制条件制备出各种炮制品，并描述炮制品的形状，见表 1。（2）有效成分的制备：取适量生品，炮制品粉末通过水蒸气蒸馏提取方法制备出水提物和醇提物，取各炮制品粉末（过 60 目） ，按药典法测定其水浸出物和醇浸出物含量，见表1。（3）药液的制备：取生品及各酒制样品粉末（过 60 目） ，用 10 倍量蒸馏水煎煮 1h，趁热抽滤。药渣加 10 倍量蒸馏水煎煮 1h，趁热抽滤,合并滤液, 60旋转蒸发浓缩，再稀释成某一剂量。（4） 采用 HPLC 方法分析山茱萸饮片的提取的环烯醚萜苷类成分，比较炮制前后的变化规律。（5）采用苷类的提取分离方法提取分离环烯醚萜苷类，以药效学实验跟踪筛选，直至得到有效单体。初步确定有效部位及有效单体。用薄层扫描法测定山茱萸中有效成分莫诺苷和熊果酸。（6）应用 IR、UV、NMR、MS 光谱鉴定化学成分结构。2化学部位、化学成分的药效学研究取小鼠随机分组,每组 10 只。各组每日按 20ml/kg 剂量灌胃给药 1 次,连续 7 日。对照组给予同体积的生理盐水。末次给药 1h 后,小鼠眼眶取血, 3000 r/min 离心 10min,取血清依照试剂盒说明书上要求检测血清总超氧化物岐化酶( SOD) 、丙二醛(MDA) 。见表 2表 2 山茱萸生品及各酒制品对肾阴虚模型小鼠的影响组别 剂量(g/kg) 游泳时间(s ) 耐缺氧时间 (s ) SOD(U/ml) MDA(mol/ml) 生理盐水生品酒制品 1酒制品 2酒制品 3酒制品 4酒制品 5酒制品 6酒制品 7酒制品 8酒制品 93. 指纹图谱研究采用高效液相色谱法对环烯醚苷类成分进行指纹图谱研究，以整体水平评价山茱萸生品和不同酒制品的化学成分变化规律。4.对 9 种炮制品进行称重,计算其收率,按照 2010 年版中国药典附录H 项第一法烘干法,对山茱萸及其酒制品进行水分含量测定，见表 1。5.按照 2010 年版中国药典附录项 k 法灰分测定法,对山茱萸及其酒制品进行灰分含量测定，见表 1。6取各炮制品粉末 10g, 精密称定, 采用高锰酸钾法 ,测定各样品中鞣质含量，见表1。7.用薄层扫描法测定山茱萸中有效成分熊果酸和莫诺苷,见表 1。8.马钱素的含量测定：RP-HPLC 法1.固定相: YWG- C18 柱；流动相: 甲醇-水(3070) ；检测波长: 236 nm；柱温:室温; 流量: 1. 0mL/ min ；理论塔板数按马钱素峰计算不低于 3000。在此条件下, 马钱素与其它组分均能达到良好分离(分离度均应不低于 2. 0) 。根据马钱素的 UV 吸收图谱, 确定其检测波长为 236 nm。2.对照品溶液的制备：取马钱素对照品适量，精密称定，加 80%甲醇制成每 1ml含 40g 的溶液，即得。3.供试品溶液的制备:取本品粉末约 0.1g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇 25ml,称定重量，加热回流 1 小时，放冷，再称定重量，用 80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。4.精密吸取供试品溶液与对照品溶液各 10l,注入液相色谱仪，测定，结果见表1表 1 各种指标的测定含量（%）质量（g）水浸出物 醇浸出物 熊果酸 莫诺苷 马钱素 水分总灰分 鞣质生品酒制品 1酒制品 2酒制品 3酒制品 4酒制品 5酒制品 6酒制品 7酒制品 8酒制品 9含量（%）质量（g）水浸出物 醇浸出物 熊果酸 莫诺苷 马钱素 水分总灰分 鞣质 性状生品酒制品 1酒制品 2酒制品 3酒制品 4酒制品 5酒制品 6酒制品 7酒制品 8酒制品 95.方法学考察5.1 线性关系考察：精密量取马钱素对照品 Xmg，用甲醇溶解后定容于 10ml 容量瓶中，作为马钱素标准贮备液, 精密加甲醇使分别稀释成 0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg /m l 的马钱素对照品溶液，进样 10l， 以标准溶液浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行回归计算,得回归方程，判断马钱素在一定浓度范围内线性关系是否良好。5.2 精密度试验: 精密吸取上述对照品液 10ul ，重复进样 6 次，测 6 次的马钱素峰面积，计算马钱素峰面积的 RSD(n=6)，判断其精密度是否良好。5.3 稳定性试验：取酒制品 1 号溶液，分别在制备后 0、2、4、6、8、10、12 h 进样 10l 测定峰面积,计算马钱素峰面积积分值 RSD(n=7)，判断其稳定性是否良好。5.4 加样回收率实验：精密称取马钱素对照品 2.5mg，共 5 份，分别加入 0.5g 精密称定的山茱萸粗末中，提取方法同样品的制备，依法测定