柑橘中多菌灵的提取及薄层色谱研究

邵阳学院 2014 届毕业论文 毕业论文课 题 名 称 柑橘中多菌灵的提取及薄层色谱研究 乙腈作提取剂 学 生 姓 名 胡 恒 学 号 1040904091 系、年级专业 生物与化学工程系 10 食品质量与安全 指 导 教 师 夏 湘 职 称 副 教 授 2014 年 5 月 26 日邵阳学院 2014 届毕业论文 I柑橘中多菌灵的提取及薄层色谱研究胡 恒（邵阳学院生物与化学工程系食品质量与安全专业 邵阳 422000）指导老师：夏 湘摘 要目的：以乙腈做提取剂，采用水浴超声、机械震荡等方法提取，利用薄层层析分离净化，研究探讨并建立比较简单的柑橘中多菌灵的提取、净化操作条件，为农残的检测提供理论依据，并初步学会科学研究方法，提高实践能力。方法：以乙腈做提取剂，采用水浴超声、机械震荡等方法提取，通过薄层色谱确定柱层析合适的洗脱剂。结果：通过实验得到柑橘中多菌灵的较为合适的提取、净化条件。结论：本方法廉价、快速、操作简便、提取净化效果较好，可以满足食品工业分析要求。关键词：多菌灵；提取；净化；薄层色谱邵阳学院 2014 届毕业论文 IIStudy on Extraction and thin-layer chromatography of spirit in CitrusHu Heng(Department of Biology and Chemistry Engineering, Shaoyang University,Shaoyang 422000, China)Counselor:Xia XiangAbstractObjective:Using acetonitrile as extractant, extraction by water bath andultrasonic, mechanical shock method, separation and purification by TLC, to study and to establish a relatively simple orange carbendazim in the extraction,purification and operation conditions, to provide the theoretical basis for thedetection of pesticide residues, and initially learn scientific research methods,improve the practice ability. Methods: using acetonitrile as extractant, extractionby water bath and ultrasonic, mechanical shock and other methods, by thin layer chromatography to determine the appropriate eluent column chromatography.Results: the orange carbendazim extraction, suitable purification conditionexperiment. Conclusion: The method is cheap, fast, convenient operation,extraction and purification effect is good, Which can meet the requirements of the food industry analysis.Keywords: Carbendazim; extraction; purification; thin layer chromatography 目 录摘 要 .IAbstract.II1 前言 .11.1 薄层色谱的应用.11.2 国内外现状及研究水平.21.3 研究展望 .52 材料与方法 .52.1 材料、试剂和仪器 .52.2 实验方法 .52.3 净化.63 结果与分析.73.1 提取条件的选择. .73.2 净化条件的选择 .74 结论.9 参考文献.10 致 谢.12邵阳学院 2014 届毕业论文 11.前言多菌灵 (Carbendazim)又称苯骈咪唑 44 号，化学名称 2-(甲氧基氨基甲酰)苯骈咪唑，属苯并咪唑类杀菌剂，该药剂于 1960 年由 Hampel 发现具有杀菌活性，1973 年我国开始进行研制并投放市场，纯品为白色结晶粉末，215217开始升华，熔点 308311，工业原料为浅棕色粉末，是一类高效、广谱、内吸性杀菌剂，它的作用机理是通过干扰植物细胞纺锤体形成, 从而影响细胞的分裂, 对植物具有良好的治疗和保护作用，已广泛应用于防治由半知菌和担子菌引起的农作物、果树及经济作物上的一些病害。因为其化学性质稳定，一般可通过农作物叶片和种子渗透到植物体内，耐雨水冲洗，残效期比较长；可通过食物链进入人体内。多菌灵对人畜低毒，但是如果长期摄入，在体内积累可能会导致慢性或急性毒性而影响人体健康，对人体有一定危害，所以对农作物中多菌灵残留量的检测越来越受到重视 1-2。我国、日本以及欧盟都分别对这类杀菌剂规定了最高允许残留限量。我国卫生部和农业部在 2011 年联合发布了食品中多菌灵最大残留限量标准 ，并在当年 4月 1 日开始实施。最大残留限量为柑橘 5mg/kg，韭菜为 2mg/kg，西瓜0.5mg/kg。在检测柑橘中的多菌灵残留时，液相色谱法、分光光度法等方法的基质效应严重，使检出限比较高，难以检出超痕量的多菌灵，因此，有必要对柑橘中多菌灵的提取和净化工艺进行研究，为更好的检验农残提供参考依据。1.1 薄层色谱薄层色谱 3(thin layer chromatography，TLC)是一种简便、快速、高效、廉价、应用非常广泛的色谱分析方法，是20世纪50年代在经典柱色谱法和纸色谱法的基础上发展起来的一种色谱分析技术。薄层色谱的特点是可以同时分离测定多个样品，分析成本较低，对样品预处理要求不高，对展开剂的选择自由度比较大，适用于含有不易从分离介质脱附或需要色谱后衍生化处理的样品分析。TLC已经广泛应用于药物、生化、食品和环境分析等方面，在定性鉴定、半定量以及定量分析中发挥着重要作用。同时可通过薄层色谱来选择适宜的展开剂作为柱色谱法的洗脱剂。邵阳学院 2014 届毕业论文 21.2 国内外现状及研究水平目前检测多菌灵的方法主要有液相色谱法、分光光度法、液相-质谱联用法、脉冲伏安法等，提取方法主要有液液萃取、固相萃取等。1.2.1 检测方法（1）高效液相色谱法高效液相色谱是 20 世纪 60 年代末发展起来的一种新型分离技术，通过不断的改进与发展，现在已经成为一种应用非常广泛的化学分离分析的重要手段。它是从经典液相色谱基础上，加入气相色谱的理论，并且采用了高效固定相和高灵敏度检测器，因此具备效率高、速度快、灵敏度高、操作自动化的特点。高洁 4等采用高效液相色谱法检测了黄瓜中多菌灵的残留量，样品经丙酮/水=7/3(v/v)提取,在只控制 pH 值的条件下，用乙酸乙酯萃取净化，反萃取后浓缩，高效液相色谱(DAD 检测器测定),紫外检测波长为 280nm。该方法的平均回收率为78.50%90.01%，变异系数范围是 4.4%7.5% ，最低检出限为 0.05mg/kg。方法的精密度和准确度完全符合农药残留分析的要求。此外，采用 HPLC 法检测多菌灵残留量的相关研究报道还可见对油菜籽 5、葡萄酒 6、大豆植株和土壤 7、以及芦笋 8中多菌灵残留量的测定。（2）分光光度法分光光度法是通过在特定波长处或一定波长范围内测定被测物质的发光强度，从而对该物质进行定性和定量分析的方法。范宁云 9等在用分光光度法测定蔬菜中多菌灵的含量时，发现此方法不仅简化了操作步骤，避免了加热过程中对环境造成的污染，缩短了检测的时间，还一定程度的提高了样品加标回收率。而且在数据处理中，省去了谱图扫描以及计算等繁琐过程，可通过计算机进行三波长数据处理，减轻了计算的劳动强度，加快了数据处理过程。季凤英 10等用甲醇作溶剂,在室温下对桑叶中多菌灵进行提取,在盐酸溶液-氯仿中净化,用 0.3mol/L 的 HCL 溶液作参比建立了桑叶中多菌灵的紫外光谱测定方法，方法回收率在 90%96 环之间。浓度在 0-20mg/L 范围内呈线性关系。（3）导数同步荧光法邵阳学院 2014 届毕业论文 3同步荧光法技术是由 Lloyd 首先提出的，它与常用的荧光测定方法相比最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长。由测得的荧光强度信号与对应的或发射波长 组成光谱图，通常称为同步荧光光谱。同步荧光法具有选择性好，灵敏度高和干扰少等优点，目前在医学、环境科学等研究领域已经被广泛应用。导数技术应用于荧光分析，在解决荧光测定中的背景影响和谱带重叠的问题中收到了良好的效果，还有利于提高灵敏度，是一种混合物分析的快速简便的方法。蔡世炎 11等在测定了香菇中的多菌灵时采用导数同步荧光法，该方法主要是简便快速，不需要进行复杂的前处理。经实验测得香菇中多菌灵的线性范围为0.052.5 mg /kg，检出限为 0.63g /kg，回收率也达到了 96%101%。（4）同位素标记法刘振坤等 12采用同位素 14C 示踪技术对云杉幼苗及土壤中多菌灵残留进行了分析研究,在防治云杉雪霉病和雪枯病时研究了初冬喷施多菌灵，在雪盖条件下，根据药剂在云杉幼苗和土壤中的残留动态。从而筛选出田间试验的多菌灵，以及甲基托布津、粉锈宁等杀菌剂的防治效果做出了准确的评价，平均回收率为 91%。（5）液相-质谱联用法吴永江 13等用高效液相色谱-质谱联用法定量检测了铁皮石斛、西洋参药材及其制剂中的多菌灵残留。在酸性条件下用甲醇提取了中药材和制剂中的残留多菌灵，分析色谱柱为 DiamonsilC18(4. 5 mm .i d.250 mm,4m)，以 4%四氢呋喃水溶液-甲醇梯度洗脱，采用选择离子监测模式，以 m /z192 为检测定量离子。多菌灵出峰时间在 28min 左右，线性范围为 0. 2233 ng，相关系数 0. 9991，方法检出限为 0. 015 mg /L，定量限为 0. 021mg /L，平均回收率在 95. 5%以上。该方法灵敏、准确、耐用性很强，完全可以作为中药中多菌灵残留的可靠检测方法。（6）脉冲伏安法陈丽东 14等制备了纳米金-多壁碳纳米管复合物修饰电极，用循环伏安法研究了多菌灵在该修饰电极上的电化学行为，结果表明：多菌灵在 1.08V 处出现了一个不可逆氧化峰，该氧化过程受扩散控制，110 -6mol/L110-4mol/L 范围内，脉冲伏安法的氧化峰电流与多菌灵浓度呈现出线性关系，该复合物修饰电极可快速、灵邵阳学院 2014 届毕业论文 4敏地检测溶液中多菌灵含量。 1.2.2 提取方法（1）液液萃取法液液萃取法又称溶剂萃取或抽提，用提取液体和溶剂分离混合物中的组分的过程。在液体混合物中加入与之不相混溶的选定的溶剂，利用其组分在溶剂中的溶解度不同而达到分离或提取的目的。余向阳等 15用 甲醇超声提取了通过液液萃取法粉碎的小麦籽粒, 然后减压抽滤, 再加入 HCL, 充分震荡后用二氯甲烷萃取溶液, 然后加氨水将 pH 值调至 69 再用二氯甲烷萃取多菌灵, 将有机相经无水 Na2SO4 干燥即可。王勇尊 16等建立了一种以支撑介质液液萃取= 高效液相色谱法为基础，快速测定果汁中多菌灵农药残留的分析方法，对苯并咪唑类农药中具有代表性的多菌灵样品进行前处理，再结合高效液相色谱法进行分析检测。在优化液相检测条件和萃取条件的同时，从添加回收率、方法定量限等方面对此方法进行了评价与验证。结果表明，使用介质液液萃取的方法萃取蜜桃汁样品中的多菌灵，添加回收率的平均值达到 94%以上，方法最低检出限为 0.014ug/ml，方法定量限为 0.004ug/ml，方法具有前处理简单、分析速度快、经济、分析时间短、重复性好等优点，可应用到其它果汁中多菌灵农药残留的检测中。（2）固相萃取法固相提取法（SPE） ，又叫液固提取法。它是指液体样品中的分析物通过吸着（吸附和吸收）作用被保留在吸着剂上，然后用一定的溶剂洗脱的过程。Nozal 等 17采用固相萃取法对样品进行前处理, 采用液相色谱-质谱( LC-MS)联用技术对葡萄酒中多菌灵等九种农药的残留量进行了分析测定。最低检出限为9Lg/L31Lg/L, 回收率为 102.5%108.8%。吴刚 18等采用 ASE- SPE 萃取液相色谱分析法分析了干香菇中多菌灵残留量。具体方法为：用溶剂萃取( ASE) , LC- SCX 小柱净化,以甲醇+乙酸铵(44+ 56, 体积分数) 为流动相, 紫外检测器(280 nm) 的高效液相色谱仪对待测组分进行分离和测定。结果干香菇样品中多菌灵添加回收率在 75% 105% 之间, 相对标准偏差( RSD,n=6)小于 9% , 多菌灵在样品中的最低检出浓度为 0.102 mgPkg。郭英娜 19等建立了以固相萃取技术和高效液相色谱法共同进行分离和检测多菌邵阳学院 2014 届毕业论文 5灵和噻菌灵 2 种杀菌剂的方法。环境水中的多菌灵和噻菌灵用 3M Empore 6 mLC18Cartridge 进行固相萃取，优化得到高效液相色谱分离条件，流动相为甲醇-水(50： 50，V /V)；流速为 0. 6mL /min；柱温为 55 ；在 286 nm 波长下检测，结果检出限为 0. 06 mg /L。本法操作简便，灵敏，回收率较高。1.3 研究展望随着人们生活水平的提高，对食品安全越来越重视，以及食品中农药残留检测方法的相继建立，理想分析方法应是简单、快速、准确、有效、灵敏、专一、经济等特点。高效液相色谱法、导数同步荧光法、液相-质谱联用法是近年发展起来检测方法，此类检测方法比较准确、稳定，但所需要的仪器设备投资太大，对操作技术要求也高，暂时未能得到广泛应用；而分光光度法具有灵敏度高、检测时间段、成本低等优点，适于批量检测，但检测限较高。随着待测食品种类扩大和食品基质成分复杂化，来自食品中非测定成分干扰将日益增多。因此对检测手段要求将越来越高，发展廉价经济、灵敏度高、专一、快速净化手段和检测方法是今后研究方向。2 材料与方法2.1 材料、试剂和仪器材料：柑橘（购于邵阳学院生活服务部超市）试剂和药品：多菌灵标准样品；硅胶（吸附剂） ；饱和无水硫酸钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技公司） ；甲醇（色谱纯，天津市永大化学试剂开发中心） ；乙醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技公司） ；乙腈（分析纯；天津市风船化学试剂科技公司） ；乙酸乙酯（分析纯；天津市风船化学试剂科技公司） ；丙酮（分析纯；长沙湘科精细化工厂） ；水（符合 GB/T 6682，二级）仪器：研钵；锥形瓶；烧杯；漏斗；试管；量筒；移液管；分析天平；玻璃棒；玻璃板；涂布器；点样器；毛细管；刮刀；层析缸；干燥器；水浴锅；恒温干燥箱；高效液相色谱仪（北京凯奥科技发展有限公司） ；磁力搅拌器（最大转速 5000 r /min） ；水浴超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司） ；九阳榨汁机2.2 实验方法2.2.1 实验原理邵阳学院 2014 届毕业论文 6本实验用乙腈作提取剂提取柑橘中的多菌灵，分别采用用机械震荡法和