微波提取金银花中总黄酮的研究VIP

I微波提取金银花中总黄酮的研究摘要：以水作为提取溶剂，采用微波提取的方法，从中药材金银花中提取总黄酮，以芦丁为对照品，加入显色剂后，以相应试剂作空白,用分光光度法对所提取总黄酮的含量进行了测定。以金银花中总黄酮的含量为考察指标，讨论了微波提取料液比、提取功率、提取时间等因素对总黄酮提取效果的影响。确定了每个因素的最佳范围。通过正交试验，确定微波提取金银花中总黄酮的最佳工艺条件为：料液比1:20，提取功率为440W，提取时间7min。并与传统水回流法对照，经F-检验法及t-检验法检验，测定结果没有显著性差异。实验表明，微波法提取金银花中的总黄酮,产率较高,时间较短,提取时间由传统回流的2小时缩短为7分钟,且设备简单,操作简便,可作为提取金银花中总黄酮化合物的一种有效方法,亦可借鉴于其它中草药中有效成份的提取。关键词：金银花；总黄酮；微波；正交实验IIMicrowave extraction honeysuckle in the study of flavonoidsAbstract：With water as a solvent extraction, microwave extraction method, extracted from Chinese herbal medicines honeysuckle total flavonoids, a reference substance for Rutin, adding reagent, to the corresponding blank reagents for use by spectrophotometry from the total of Flavonoids in the determination. Honeysuckle to the content of flavonoids in indicators for the study, discussed the microwave extract liquid than expected, from power, extraction time on the effects of flavonoids extracted. Identified the best of each factor. By orthogonal pilot, identified microwave extraction of flavonoids in the Honeysuckle the optimum conditions: feed than 1:20, the power to extract 440 W, extraction time 7 min. And return to the traditional method of water control, the t-test and F-test test, results of no significant difference. The experiments show that microwave extraction honeysuckle in the total flavonoids, a higher yield, shorter hours, the extraction time by the return of the traditional two hours shortened to seven minutes, and the equipment simple, easy to operate and can be used as extracting gold and silver Flavonoids total spent in an effective way, can also draw on other elements of Chinese herbal medicine effective in the extraction.Key words：Honeysuckle; total flavonoids; microwave; orthogonal testIII目录1 前言(1)1.1 微波提取理论基础(1)1.1.1 微波提取的原理(1)1.1.2 微波提取的特点(1)1.1.3 微波提取的影响因素(1)1.2 金银花的简介(2)1.2.1 金银花(2)1.2.2 金银花的品种和资源分布(2)1.2.3 金银花的药理作用(2)1.2.4 金银花的研究进展(3)1.3 本文的研究内容(3)2 实验部分(4)2.1 主要仪器和试剂(4) 2.2 实验方法(4) 2.2.1 供试样品溶液的制备(4)2.2.2 测定波长的选择(5) 2.2.3 标准曲线的绘制(6) 2.2.4 稳定性实验(7) 2.2.5 水回流法提取和测定金银花中总黄酮(7) 2.2.6 微波法提取和测定金银花中总黄酮(8) 2.2.7 单因素实验及正交实验(8)3 结果与讨论(9) 3.1 水回流法提取金银花中总黄酮测定结果(9) 3.2 微波方法的单因素实验(9)3.2.1 料液比的影响(9) 3.2.2 提取时间的影响 (10)3.2.3 提取功率的影响 (11) 3.3 正交实验 (12)IV3.3.1 正交实验方案 (12)3.3.2 正交实验结果与分析 (13) 3.3.3 验证试验 (14) 3.3.4 回收率试验 (14) 3.3.4 两种方法测定结果的比较 (15) 4 结论 (15)致谢 (16)参考文献 (17)微波提取金银花中总黄酮的研究1.前言1.1 微波提取理论基础1.1.1 微波提取的原理微波是一种波长在10.001m、频率在0.3300GHz 的电磁波，它具有波动性、高频性、热特性和非热特性四大基本特性 1。微波提取植物样品中有效成份的机理，是微波辐射高频电磁波穿透萃取介质，到达物料的内部维管束和细胞系统，样品吸收了微波能，细胞内部温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，细胞破裂。细胞内有效成分自由流出，使得在较低的温度条件下被提取介质捕获并溶解 2。通过进一步过滤和分离，便获得提取物料。1.1.2 微波提取的特点微波提取技术作为一种新型的提取技术，有其独特的特点。首先体现在微波的选择性，因其对极性分子的选择性加热从而对其选择性的溶出；其次，微波可以大大降低提取时间，提高提取速度；再者，微波提取受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多，同时减少了溶剂的用量；另外，微波提取如果用于大生产，则安全可靠，无污染，属绿色工程，生产线组成简单，并可节省投资。与其它提取技术如自动索氏抽提、超声提取、快速溶剂萃取等方法相比，微波快速溶剂提取和快速溶剂萃取在溶剂使用量上和提取时间上都有很大的优势，但是微波提取具备了快速溶剂萃取所没有的大批量、大样品量处理的能力，对于常见样品的提取，回收率也教令人满意，所以微波辅助提取技术要优于其他技术。1.1.3 微波提取的影响因素影响微波提取的因素很多，如提取溶剂、微波功率、微波提取时间、植物中的含水量、溶液的 pH 值、温度等是诸多因素中影响较大的几种。其中溶剂的极性对微波提取效率有很大的影响，溶剂对分离成分的溶解能力也会干扰到提取成分的后续操作，已见报道用于微波提取的溶剂有：甲醇、丙酮、乙酸、二氯甲烷、正己烷、苯和甲苯等有机溶剂及硝酸、盐酸、氢氟酸和磷酸等无机试剂，以及己烷一丙酮、二氯甲烷一甲醇和水一甲苯等混合溶剂等 3。提取剂的用量与比例则因物料的不同而有差异，一般提取剂与物料之比在 1：120：1范围内选择。同时所需微波剂量以及提取时间也将会直接影响到提取的效果，一般所选的微波功率在 2001000W，频率 2000 300000MHz，而时间不宜过长，以免沸腾造成有效成份的分解及损失，提取回收率随提取时间的延长有所增加。此外，植物中的含水量、溶液的 pH 值和温度对微波提取效果的影响也很明显，对于不同的植物样品，不同的提取成份和不同的提取剂，介质的 PH值，也不尽相同；对不同物质的提取温度也不完全相同，一般为 6070为宜。1.2 金银花的简介1.2.1 金银花金银花(Lonicera Similis Hemsl),为忍冬科(Ca-prifoliaceae)忍冬属(Lonicera L) 植物的花蕾或初开的花 4，生于盐碱地、沙土薄地、肥田、丘岭、山坡 、路旁灌丛或疏林中。分布北起辽宁，西至陕西，南达广西北部，西南至贵州、云南各省区 5。它的别名为：二花、双花、金花、银花和忍冬花等。1.2.2 金银花的品种和资源分布1995年版一部,收载了忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬L.hypoglauca Miq 、山银花L.confusa DC.、毛花柱忍冬L.dasystyla Rehd .,为金银花的4个法定药用品种 6。金银花别名银花、双花,药用部位为忍冬、红腺忍冬、山银花、毛花拄忍冬的干燥花蕾或带初开的花,主产于山东、河南等地。全国大部分地区均有野生或零星栽培,栽培历史以有200年以上。其中河南的南银花和山东的东银花质量佳,产量高,最为有名,畅销国内外。1.2.3 金银花的药理作用抗病原微生物：实验证明金银花对各种致病菌、病毒，如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、百日咳杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、脑膜炎双球菌、皮肤真菌、流感病毒、钩端螺旋体，均有不同程度的抑制作用 7。增强免疫功能：金银花能促进淋巴细胞转化，增强白细胞的吞噬功能。抗炎、解热：金银花能促进肾上腺皮质激素的释放，对炎症早期的毛细血管通透性增高和渗出性水肿有明显的抑制作用。抑制溃疡作用：金银花对消化性溃疡有轻度的预防作用。抗病毒作用：用组织培养法筛选发现金银花对上呼吸道感染有关的不同病毒株有抑制或延缓细胞病变作用 8。1.2.4 金银花的研究进展一般认为金银花的抗菌有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的优劣。绿原酸虽具有广谱的抗菌性、抗病毒作用，但金银花化学成分复杂，还有三萜及三萜皂苷类、环烯醚萜类、苯丙素类、有机酸衍生物等成分，况且绿原酸在体内能被蛋白质灭活，其抗菌作用并不甚强。近年来的研究发现，金银花中的三萜皂苷及其他一些成分也有很强的生理活性，因此有必要拓宽对其有效成分的研究范围，金银花抗菌的真正情况、药理作用、有效成分以及各有效成分的协同作用，需进一步深入研究。同时，以绿原酸和木犀草苷作为质量控制标准，还不够全面，存在着局限性，需用指纹图谱技术进行质量控制。金银花的药理作用虽然已进行了一些研究，但还只是初步的研究，如金银花的抗病毒作用，多是从金银花作为化学物质直接作用于病毒，进而影响病毒的生长。金银花的免疫增强作用研究也基本停留在免疫效应的观测上，最终只是检测一些免疫指标的变化情况，而对其是如何提高机体免疫系统对病原微生物的有效识别与杀伤，以及如何诱导、调节机体对不同病原微生物产生更有针对性的免疫应答作用机制，知之甚少。因此，有必要从分子角度，更深入地研究金银花的抗病毒作用机制，及免疫增强机制等药理作用。目前随着抗生素的广泛和大量应用，越来越多的病菌表现出对某种或几种抗生素的耐药性，而金银花对细菌耐药性的消除作用，有助于缓解这一情况。因此在此方面作更深入的研究，并探明其消除耐药质粒的分子机制，不但具有现实意义，并且对新型药物研究与开发具有一定的借鉴作用。1.3 本文的研究内容现代医学研究表明，黄酮类化合物具有降低心肌耗氧量、使冠脉和脑血管的血液流量增加、抗心律、软化血管、降血糖和血脂等作用，同时还是一种天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老、增加机体免疫力的生理活性作用 9-10。因此对其进行提取分离的研究报道较多。但日前对植物样品中黄酮类化合物的提取常采用传统的提取技术，如温浸法、水回流法、乙醇回流提取法、超声波提取法等，这些方法耗时长，提取率低，溶剂用量大，还会对环境造成一定的污染。微波提取最大特点是，选择性强、操作时间短、溶剂耗量小、速度快、提取效率高，密闭微波提取，也不会对环境产生影响，在中药提取领域表现出良好的应用前景 11。本论文利用微波提取金银花中总黄酮，并以芦丁为对照品，采用分光光度法测定总黄酮含量，讨论提取料液比、提取功率、提取时间等因素对总黄酮提取效果的影响，通过正交试验，考察了金银花中总黄酮的提取效果，并与传统、经典方法水回流法进行比较，确定了微波提取金银花中总黄酮的最佳方案。2 实验部分2.1 实验主要仪器和试剂美的牌KJ23C-AN2型微波炉(广东美的微波炉制造有限公司)，GBC-916型紫外可见分光光度计(澳大利GBC科学仪器公司),聚氯乙烯密闭溶样罐（50mL，郑州凯特瑞仪器有限公司）。金银花(广东同和堂中药饮片有限公司，粉碎过8O目筛，80烘2小时除去水分)，芦丁对照品（南京青泽医药科技开发有限公司，批号QZ071012)，硝酸铝，氢氧化钠，亚硝酸钠,无水乙醇，以上试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。5%乙醇溶液的配制：量取50mL无水乙醇,用水稀释至1000mL。30%乙醇溶液的配制：量取30mL无水乙醇,用水稀释至100mL。5%亚硝酸钠溶液的配制：称取亚硝酸钠5.000g，加适量水溶解后定容100mL。10%硝酸铝溶液的配制：称取硝酸铝10.000g,加适量水溶解后定容100mL。1mol.L-1氢氧化钠溶液的配制：称取氢氧化钠4.000g，加适量水溶解，冷却后置聚乙烯塑料瓶中加水使成100mL。芦丁标准溶液的制备：精密称取经 120减压干燥到恒重的芦丁对照品15.3mg，置烧杯中，加适量 30%乙醇，使充分溶解，定量转入 l00 mL 量瓶中，用 30乙醇稀释定容至刻度，摇匀，即得 0.153mg.mL-1 的芦丁对照品溶液.2.2 实验方法2.2.1供试品溶液的制备精密称取金银花叶 0.5000g，加 30mL 水冷浸 30min，在水浴(100)加热回流 1 h，过滤，分取滤液，药渣再加 30mL 蒸馏水，水浴 (100)加热回流 1 h，过滤，合并滤液，定量转入 100mL 量瓶中，放冷，加蒸馏水至刻度，摇匀，作供试品溶液，待用。2.2.2 测定波长的选择精密吸取芦丁标准溶液和供试品溶液适量,按标准曲线操作条件下操作显色,10min后用GBC -916型紫外可见分光光度计于 400600nm范围内进行扫描,结果显示在510nm处均有最大吸收峰(见表1、图1和表2 、图2)。表 1 芦丁的最大吸收波长波长(nm) 400 420 440 460 480 500吸光度 A 0.9310 0.6674 0.5383 0.5437 0.6190 0.6781波长(nm) 510 520 540 560 580 600吸光度 A 0.6781 0.6620 0.5706 0.4146 0.2586 0.14563604040480520560600.0.20.40.60.81.0吸光度