碱性蛋白酶改性豌豆蛋白的起泡性能研究

l- 1 -百手起驾 整理为您摘 要植物蛋白在近些年新食物产品中和传统食品中的应用，使得植物蛋白得到了大量的关注和研究。为了研究食品原料的理化性质和功能特性，必须对植物蛋白进行研究评估。由于蛋白质食物的紧缺，人们开始需求新的植物蛋白资源作为功能性食品配料和营养补充剂使用。试验研究了以 Alcalase 碱性蛋白酶改性豌豆蛋白起泡性能,分析了温度、pH 值、底物浓度、酶与底物浓度比和时间对酶水解的影响。通过均匀设计和统计分析建立了酶水解的数学模型,并以此模型得到 Alcalase 碱性蛋白酶改性豌豆蛋白起泡性能的最佳水解工艺。工艺参数为加酶量 0.16%、时间 30min、PH8.00、温度 55、底物浓度 8%。关键词： 碱性蛋白酶；豌豆蛋白；起泡性能；Title The study of alkaline protease modified pea protein aboutfoaming properties AbstractThe use of plant proteins in the formulation of new food products, or in conventional foods, has been the focus of much research in recent years. In order to develop plant proteins for use as food ingredients, their physicochemical and functional properties must be evaluated. Because of inadequate supplies and shortage of food proteins, there has been a constant search for unconventional legumes an new protein sources for use in both functional food ingredients and nutritional supplement.The preparation techniques of pea protein by Alcalase were studied. Through statistics and analyses,the effects of pretreatments, temperature, concentrations of substratum, proportions of enzyme to substratum and time on enzymic hydrolysis were studied. Through uniform designs and statistical analyses, a mathematical model was set up. Based on this model, the optimum hydrolysis conditions were determined:55,PH8.0,substratum concentration 0.16%,proportion of Alcalase to substratum8%,enzyme time 30min.Keywords： Alcalase; pea protein; foaming property;l- 3 -百手起驾 整理为您1 引言- 4 -1.1 本课题研究的目的和意义 .- 4 -1.2 国内外研究现状 .- 5 -1.3 主要研究内容 .- 5 -1.3.1 酶解对蛋白质的影响 .- 5 -1.3.2 蛋白质的起泡性与泡沫稳定性 .- 5 -1.3.3 蛋白质改性的两大技术与优缺点 .- 6 -1.3.4 蛋白质的功能特性与结构的关系 .- 6 -1.3.5 蛋白质泡沫的定义与影响因素 .- 6 -2 实验材料和方法 .- 7 -2.1 实验材料 .- 7 -2.1.1 主要实验材料与试剂 .- 7 -2.1.2 主要实验仪器 .- 7 -2.2 实验方法 .- 8 -2.2.1 基本组成成分的测定 .- 8 -2.2.2 碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉 .- 8 -2.2.3 起泡性的测定 .- 9 -2.3 实验设计 .- 9 -3 实验结果与讨论 .- 9 -3.1 单因素结果与分析 .- 9 -3.1.1 加酶量 E/S(W/W) .- 9 -3.1.2 底物浓度 .- 10 -3.1.3 酶解时间 .- 11 -3.1.4 温度影响 .- 12 -3.1.5 PH 影响 .- 12 -3.2 响应面实验设计与结果 .- 13 -3.2.1 实验结果回归分析 .- 14 -3.2.2 响应面实验优化分析与结果 .- 16 -致 谢 .- 21 -参 考 文 献 .- 22 -1 引言1.1 本课题研究的目的和意义在近几年中，植物蛋白质在新的食品或者传统食品构成中，都得到重视和研究 1。我国人口众多，蛋白质资源不足，充分利用农副产品加工工业中的大量副产物作为新蛋白质资源进行开发加工制成有价值的产物，已成为一项解决我国蛋白质资源不足的长期战略任务 2。蛋白质由于是氨基酸组成的，供人体生长，提供食品的功能特性，所以是必不可少的食物成分 3。但由于大多数豆类蛋白质的分子量大，分子内部结构复杂，使得豆类蛋白的消化率远不及牛奶等动物蛋白 4。随着国民经济的发展及膳食结构的合理化，不断应用新技术改造食品传统加工工艺已成为势不可挡的局面 5。植物蛋白质资源的综合开发利用一直是蛋白质利用研究的重点 6。基于消费者对安全的考虑和饮食文化，蛋白质工业向植物蛋白转变 7。因为在食品和非食品领域都有需求，植物蛋白产品正在蓬勃发展 8。食品趋势中更多的局限于大豆蛋白仅仅是因为关于其它植物蛋白研究的较少 9。为了深度开发豌豆蛋白质资源和提高产品附加值，豌豆蛋白质功能特性的研究显得十分必要。豌豆经分离去除淀粉后，残夜浓缩后得到豌豆蛋白质，它具有很高的营养价值，蛋白质含量在 63%-68%之间，氨基酸含量大于 60%，具有较高的消化吸收率（大于 80%） ，作为食品添加剂可替代部分肉蛋白用于食品加工中，如火腿肠，香肠等加工中 10。蛋白质改性的发展方向主要为采用新的酶类在分子层面改性修饰蛋白质，强化某些需要的特性，以获得具有特殊功能的专用型蛋白质 11。蛋白质的起泡性质是食品所需的一个非常重要的功能特性，搅打或起泡过程，包括气泡在固相或半固相中的分散及稳定，可以是食品材料中产生气孔结构，是食品加工过程中的一个单元操作。起泡操作一般用于制作轻质食品，并通过改变内聚力及柔韧性等方面来改进食品的表观及质地，起泡操作利用零成本的空气作为原料，已经制作出了很多适合消费者选择的食品，食品的起泡性质不仅取决于气体膨胀率及泡沫大小分布，还与气泡的微观结构及主体与气相界面组分的分散度有关 12。蛋白质的功能性质一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物理化学性质，即对食品的加工，贮藏，销售过程中发生作用的那些性质，这些性质对食品的质量及风味起着重要的作用，蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系中的用途有着十分密切的关系，是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。因为食品加工影响食品的功能和营养，选择先进的技术和条件研究蛋白质在是必须的 13。蛋白质分子构想作用力包括氢键，疏水l- 5 -百手起驾 整理为您作用，二硫键以及静电相互作用等 14。蛋白质的功能性质可分为水化性质，表面性质，蛋白质-蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型，主要包括有吸水性，溶解性，保水性，分散性，黏性和粘结性，乳化性，起泡性，凝胶作用，调色性。1.2 国内外研究现状目前，豌豆蛋白质提取以及功能特性研究的文献报道较少，陈宝江等人研究了豌豆蛋白作为饲料蛋白源的可行性，为了更好的利用豌豆蛋白质和提高产品附加值，豌豆蛋白质功能特性的研究显得十分必要。本实验首次从蛋白酶浓度，底物浓度，酶解时间，温度，PH 等方面对豌豆蛋白质起泡性（FAI）和泡沫稳定性（FSI）两个方面进行系统研究。1.3 主要研究内容1.3.1 酶解对蛋白质的影响酶解主要引起蛋白质三个方面的变化：1 极性基团如氨基和羧基数目增加，从而使蛋白质与水的作用得以加强；2 多肽链平均分子量降低；3 蛋白质分子构想发生变化。这三个作用均有利于蛋白质在水中的溶解。1.3.2 蛋白质的起泡性与泡沫稳定性蛋白质的起泡性包括气泡能力和泡沫稳定性，其中起泡能力是指蛋白质在加工中体积的增加率，即形成泡沫的能力，而泡沫稳定性是指泡沫产生后的稳定能力，即泡沫的寿命，溶液起泡的主要机理是因为液相表面张力的降低，蛋白质类起泡剂能降低表面张力的能力有限，但是它可以形成具有一定机械强度的薄膜，这是因为蛋白质分子之间除了范德华力外，分子中的羧基与氨基之间有形成氢键的能力。生成的这种膜能够有效降低液相的表面张力，从而形成稳定的泡沫。不过蛋白质溶液要形成气泡，还首先应充分溶解蛋白质，使到达气泡表面的蛋白质浓度提高，这样才能最终使膜生成。蛋白质的起泡性与蛋白质浓度，PH 值及温度有关，比如大豆蛋白，以偏碱性的PH 值为有利，一般最佳发泡温度为 30 摄氏度。如大豆分离蛋白丰富的性能和品质，所以其在食品组成中更有研究吸引力 15。脂质的存在对蛋白质的起泡有不利的影响，而糖类则可提高粘度，增加泡沫的稳定性。常见的蛋白质的功能特性改善技术有：物理改性，酰化作用，磷酸化作用，脱氨基作用，糖基化作用，共价交联作用，蛋白质水解作用。物理改性是利用加热，机械作用，高频振荡等方式来改变蛋白质的物理性质 16。1.3.3 蛋白质改性的两大技术与优缺点蛋白质水解作用又可以分为非酶法和酶法两大类，非酶法是最常使用的改性技术，由于其反应简单，应用广泛和效果显著的特点而倍受欢迎，但是非酶法也存在着反应条件苛刻，试剂专一性不强，最终产品中出去未反应试剂较困难等不足之处，酶法改性已有了很大的发展，酶促反应速度快，条件温和，专一性强，更重要的是一些低廉生物酶的出现，酶法反应通常为湿法反应，生产成本高 17。但是不破坏氨基酸结构，产生有害物质的可能性小，安全性高，水解产物是小分子肽和氨基酸，易为人体消化，吸收，也更适于食品加工领域的应用 18。1.3.4 蛋白质的功能特性与结构的关系豆类蛋白的功能特性与其结构有关，即氨基酸组成，排列顺序，构象，分子的形状和大小，电荷分布以及分子内和分子间键的作用，高比例的极性残基影响肽链间相互作用，水化作用，溶解性和表面活性，疏水性相互作用在在蛋白质三级折叠中相互作用，影响乳化作用，起泡性和风味结合能力，带电氨基酸能增强静力相互作用，起到稳定球蛋白，巯基能被氧化形成二硫键，硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变特性，共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小，形状，表面电荷，所有这些性质又受 PH，温度等环境因素及加工处理的影响。1.3.5 蛋白质泡沫的定义与影响因素蛋白质的泡沫主要由蛋白质溶液包裹着的小气泡群体组成，溶液受到急速的机l- 7 -百手起驾 整理为您械搅拌时，有大量的气体混入，形成许多水-空气界面，蛋白分子吸附到这些界面上，降低界面张力，促进界面形成，所谓的稳定性，就是指泡沫形成以后能保持一定时间，并具有一定的抗破坏能力。所以蛋白质可否作为良好的起泡剂取决于以下两个方面的能力，即蛋白质迁移至界面的速率和其形成稳定膜的能力 19。最后在稳定的泡沫体系中，蛋白质多肽链相互作用缔合形成连续的分子间聚合物，包围空气泡。此泡沫是由液态连续相包裹空气分散相所形成，PH 值，能量供应和溶质的存在都会影响蛋白的起泡能力 20。2 实验材料和方法2.1 实验材料2.1.1 主要实验材料与试剂豌豆蛋白粉:山东健源食品有限公司。碱性蛋白酶：Alcalase 2.4L FG，诺维信中国投资有限公司。 十二水合磷酸氢二钠（分析纯） ，柠檬酸（分析纯） 。2.1.2 主要实验仪器箱式电阻炉 SX-2.5-10 型 上海实验电炉厂全自动定氮仪 2300 福斯特卡托公司（瑞典）电子分析天平 AY-120 日本岛津制作天平所磁力加热搅拌器 78-1 江苏省金坛市医疗仪器厂电热恒温水浴锅 HH-S 北京中兴伟业仪器有限公司精密 PH 计 PHS-3C 型 上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂电热鼓风干燥箱 101 型 北京市永光明医疗仪器厂恒温振荡器 CHA-S 金坛市华峰仪器有限公司离心机 LDA-2 北京医用离心机厂高速切乳化机 FA25 上海弗鲁克液体机械制造有限公司2.2 实验方法2.2.1 基本组成成分的测定水分含量的测定:按 GB 5009.32010 直接干燥法测定灰分含量的测定:按 GB 5009.42010 灼烧称重法测定粗脂肪含量的测定:按 GB 5009.5-2003 索氏抽提法测定粗蛋白含量的测定:按 GB 5009.52010 凯氏定氮法测定缓冲溶液的配制如下：表一 磷酸氢二钠- 磷酸二氢钾缓冲液（1/15mol/L）的配制pH 1/15mol/L Na2HPO4 1/15mol/LKH2PO44.92 0.10 9.905.91 1.00 9.006.98 6.00 4.008.04 9.508.98 10.000.5001/15mol/LNa2HPO4的配置：取23.876g Na2HPO412H2O溶于蒸馏水后定容至1000mL；Na 2HPO412H2O 分子量=358.14。1/15mol/LKH2PO4的配置：取9.073g KH2PO4溶于蒸馏水后定容至 1000mL；KH 2PO4 分子量=136.09。豌豆蛋白的基本成分组成表二豌豆蛋白粉的基本成分组成及含量（% ）总蛋白 粗脂肪 水分 灰分 氮溶指数76.38 1.64 6.00 5.86 23.682.2.2 碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉采用碱性蛋白酶(Alcalase) 对豌豆蛋白进行酶解，准确称取一定量的豌豆蛋白粉l- 9 -百手起驾 整理为您于锥形瓶中，加入一定 pH 的缓冲溶液，放入事先调好温度的恒温振荡箱中振荡溶解20min；按一定的酶与底物质量之比（E/S）添加酶，在恒温振荡器中酶解一定时间；将锥形瓶置于沸水中灭酶 10 min，自来水冷却；定容，离心 (4000 r/min，10 min)，取上清液待用。2.2.3 起泡性的测定用移液管量取上清液20mL于100mL小烧杯中，用高速切乳化机以10000r/min的速度搅打2min后立即转入量筒中，分别记录0min时和30min后的泡沫体积V1 和V2，按下式计算:起泡能力=均质停止时泡沫体积(V1)/ 搅打前液体体积100%泡沫稳定性=均质停止后 30min 泡沫体积(V2)/ 均质停止时泡沫体积 (V1)100%2.3 实验设计采用碱性蛋白酶水解豌豆蛋白，探讨加酶量、酶作用时间、底物浓度、酶作用温度、pH 对豌豆蛋白起泡能力及泡沫稳定性的影响。在单因素试验的基础上，利用响应面分析法(response surface methodology，RSM)中的 Box-Behnken 软件对水解条件进行优化，进一步研究各个因素及其交互作用对豌豆蛋白起泡能力及泡沫稳定性的影响，建立响应面模型的回归方程并对每一个系数的显著性进行统计分析。3 实验结果与讨论 3.1 单因素结果与分析3.1.1 加酶量 E/S(W/W)底物浓度 4%，30min，50，pH8.0 的前提下，采用0.00%，0.04