化学荧光探针分子光谱性质的理论研究

第 1 页荧光探针分子光谱性质的理论计算摘要：应用量子力学的密度泛函（B3LYP/6-31G(*) ）计算方法研究 菁染料荧光探针分子的结构与光谱性质的关系，对单体和双体结构的菁染料荧光探针分子进行结构优化，获得电子性质以及轨道能级分布等微观信息；计算染料的吸收光谱，比较了单体和双体结构特征与其光谱的关系。关键词：荧光探针，密度泛函理论，光谱性质，理论计算Abstract: The quantum mechanics and density functional theory method (B3LYP/6-31G*) was used to study the structure and spectroscopic properties of the fluorescence probe of cyanine dyes. The structures of monomer and dimmer cyanine dyes were optimized, and their electronic properties and molecular orbital distributions were obtained. The absorption spectra of the dyes were calculated and the relationship between the dyes geometry and spectra were discussed.Key words: Fluorescence probe, Density functional theory, Spectroscopy, Theoretical calculation1 前言荧光染料是一种广泛使用的荧光标示剂，亦称为荧光探针。最常用于荧光免疫法中标记抗原或抗体，亦可用于微环境，如表面活性剂胶束、双分子膜、蛋白质活性点位等微观特性的探测，也可用于标记待定的核苷酸片断，用于特异性地、定量地检测核酸的量。荧光检测技术在DNA 杂交测试、免疫检测、基因重组检测和肿瘤细胞早期诊断等方面的广泛应用极大地促进了荧光染料的发展。荧光染料包括紫外-可见染料和近红外荧光染料。近红外荧光染料的发射波长为7001200 nm ,在该范围内生物分子自身荧光较弱,可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度。根据与生物大分子的结合方式可将近红外荧光染料分为共价键结合式和非共价嵌入式,共价键结合的标记物比由非共价嵌入所得的复合物更稳定 1。其检测原理是:通过活性基团，如:琥珀酰亚胺(NHSester)、异腈酸酯(NCS) 或邻苯二甲酰亚胺等与蛋白质、DNA 、核酸或其他生物大分子中的羟基、氨基或巯基以化学键的方式键合,使染料荧光特性发生变化,借此提供大分子结构和性能的信息 2。这类染料包括菁染料、酞菁、罗丹明及荧光素等。本课题所研究的是近红外染料中的菁染料。1.1 菁染料1856年Williams 发现了菁染料(亦称花菁) 3,17年后,Vogel 4发现该类染料具有异常灵敏的感光能力,此后菁染料得到了迅速的发展。21 世纪生命科学和能源科学已成为科技发展的核心内容,这两个学科的飞速发展极大地推动着其他学科的变革。在这些相关科学技术的发展带动下,有关菁染料的应用研究也日新月异 5。菁染料具有光谱范围广、摩尔消光系数高、荧光量子产率较高以及灵敏度高等良好的特性。随着生物技术和荧光标示技术飞速发展,菁染料已成为在DNA、蛋白质及核酸等分析检测中使用的最主要的荧光探针。其中Waggoner 等研制的N- 羧戊基-5-磺酸基-3H-吲哚菁染料Cy3和Cy5 具有良好的荧光性能和水溶性,并且由于分子中含有的羧基，能经过活化与生物大分子中的氨基共价结合,用来进行各种检测,其已成为生物芯片上使用的新一代商品化荧光探针 6-荧光探针分子光谱性质的理论计算第 2 页10。菁染料又称多次甲基染料。其结构通式见图1。其中，Y，Y=S，Se，O，NR 等；Z，Z=CC-C=CdyeD dyeA。这是因为染料 A 中有供电基团-NH 2，染料 C 中有吸电基团-NO 2。表中还给出溶剂对染料 B 中 N 原子电荷的影响，结果表明无论是吲哚还是乙胺基上 N 原子电荷都不受溶剂影响。3.2 电荷分析为了分析染料分子结构对电荷分布的影响，对染料 A 和 B 进行了布居数分析，分别得到原子的 Mulliken 电荷和 NBO 电荷。结果列于表 3。表 3 染料 A 和染料 B 的 Mulliken 电荷和 NBO 电荷对比dyeA dyeB Mulliken NBO Mulliken NBO1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 N8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 N21 C22 C23 C24 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 H34 H35 H36 H37 H-0.081717-0.092257-0.1025040.3186080.082954-0.136177-0.5787910.404697-0.131725-0.299418-0.299474-0.154723-0.0896280.119682-0.109753-0.1248880.374124-0.124210-0.129579-0.498736-0.188430-0.187778-0.2017790.1202570.1219070.1156120.1106870.1166210.1331350.1350520.1165990.1349980.1331240.0999920.1035360.1021140.112846-0.21981-0.21149-0.252520.15559-0.03660-0.21291-0.328790.34526-0.10044-0.66662-0.66669-0.34234-0.08415-0.14003-0.15996-0.279520.23997-0.29025-0.15364-0.37917-0.48981-0.49003-0.492100.259330.260180.251470.253630.239440.255580.255570.239500.255540.255580.243400.234000.242370.255111 C2 C3 C4 C5 C6 C7 N8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 N21 C22 C23 C24 C25 C26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 H34 H35 H36 H37 H-0.082691-0.092546-0.1038970.3186190.084162-0.137494-0.5766020.395388-0.131062-0.298630-0.298703-0.171980-0.0283350.126948-0.113485-0.1240970.370761-0.124789-0.128586-0.498987-0.186729-0.185997-0.200477-0.080086-0.1144980.1172550.1192240.1133130.1081780.1142250.1319700.1323830.1142560.1323700.1319670.1013940.101619-0.22308-0.21226-0.254620.15794-0.03789-0.21354-0.333490.33250-0.09898-0.66636-0.66638-0.34386-0.11761-0.13512-0.16068-0.281700.23540-0.29016-0.15638-0.38302-0.48892-0.48902-0.49106-0.28269-0.103980.257830.258750.250510.252390.238620.254920.253830.238650.253820.254910.247190.23090荧光探针分子光谱性质的理论计算第 10 页38 H39 H40 H41 H42 H43 H44 H45 H46 H47 H48 H0.1144340.1102160.1405940.1475310.1475280.1411600.1464490.1464470.1619720.1625380.1561530.256680.248690.253560.243040.243060.254020.242410.242370.255440.255580.2605238 H39 H40 H41 H42 H43 H44 H45 H46 H47 H48 H49 H50 H51 H52 H0.1030570.1096500.1110280.1094170.1377300.1453830.1453730.1381730.1444220.1444200.1603930.1532810.1602250.0973460.1057360.244270.253460.254730.248610.251960.241650.241690.252310.241130.241070.254380.258750.254360.237330.23695对于染料A, N7原子的Mulliken电荷为-0.578791，NBO 电荷为-0.32879，显然Mulliken电荷更负，而观察图3可知，N7带正电，所以NBO电荷更合理。在理论方面，因为Mulliken电荷是将两个原子之间的电子密度平均分配到每个原子上，电荷大小与计算方法所采取的基组有关，所以有时会出现不合理结果。而自然键轨道电荷考虑到了原子的电负性和化学键上的电子云的不均匀分布，所以不受基组的影响，更具合理性 5。3.3 光谱的计算根据大连理工大学精细化工国家重点实验室的研究结果，菁染料 A 和 B 的光谱性质和实验现象如下：从染料在水中的吸收光谱上看（图 8），共轭链较短的双染料（dyeA）单体对应的吸收峰消失，同时出现