中药材提取物功能研究

中药材提取物功能研究1 材料1.1 饲养动物选取体重在 1822g 的雄性小鼠，小鼠及鼠粮购于兰州大学医学校区。本实验室饲养条件：饲养房温度控制在 37，小鼠在专用鼠笼中进行饲养，每天更换水瓶，每天添加鼠粮，垫料每两天更换一次。1.2 实验器材毛巾、鱼网、卫生纸、医疗胶布、铅皮、回形针、塑料桶、小太阳、热得快、小注射器、灌喂针、鼠笼、水瓶、计时器、锡纸、称量纸、滤纸、50 mL冻存管管、5 mL 冻存管、冰盒、标记笔、Eppendorf 管、酶标板、一次性试管、10mL 玻璃试管、试管架、棕色试剂瓶、量筒、移液器及枪头、密封瓶、保鲜膜、液氮罐。1.3 实验仪器表 1-1 实验主要仪器名称 型号 产地水迷宫电子天平 CP214 中国上海恒温水浴锅 B-260 中国上海紫外分光光度计 754N 中国上海荧光酶标仪1.4 实验溶液及试剂生理盐水、4%多聚甲醛固定液、液氮、冰醋酸、浓硫酸。（1 ） 4%多聚甲醛固定液配制：NaH2PO42H2O 2.964 gNa2HPO412H2O 29.010 g多聚甲醛 40 gdH2O 1000 mL总量 1 L（2 ） A 药配制：将 A 原液稀释一倍为 I 液A 中浓度：取 I 液 50mL，定容至 200mL(按照需要剂量同比例缩小！下同 )；A 高浓度：取 II 液 150mL，定容至 200mL。（3 ） B 药配制：将 B 原液稀释一倍为 II 液B 中浓度：取 II 液 60mL，定容至 200mL；B 高浓度：即 II 液。注意：每次灌喂之前需要摇匀；剂量：0.2 毫升/10 克体重1.5 实验所需试剂盒总抗氧化能力（TAOC）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（ SOD）测试盒、肝/肌糖原测试盒、活性氧（ROS ）检测试剂盒及 BCA 蛋白定量试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。1.6 实验经费表 1-2 实验经费表名称 单价 数量 总价实验小鼠 5.00 140 700.00鼠粮 1 袋毛巾卫生纸医用胶布铅皮塑料桶电暖气热得快生理盐水锡纸液氮酶标板（96 孔）一次性试管量筒冰醋酸（500mL）浓硫酸（500mL）移液器（0 5000mL）保鲜膜T-AOC 测试盒MDA 测试盒SOD 测试盒肝/肌糖原测试盒ROS 检测试剂盒BCA 蛋白定量试剂盒1.005.0050.0010.0030.003.00150.00250.00500.00160.00680.002 条1 袋3 条4 个1 台2 个4 瓶1 卷10 L2 板5 包1 瓶1 瓶1 卷2 盒2 盒2 盒2 盒2 盒2 盒 3.0020.0050.00100.0060.00300.00500.001000.00320.001360.002 方法 2.1 小鼠体重进行称量 先将购买的实验小鼠适应性喂养 1d，然后将小鼠随机分为 6 组：A 药高浓度组、A 药中浓度组、B 药高浓度组、B 药中浓度组、正常对照组及训练对照组。每周用电子天平对小鼠体重进行称量一次并纪录数据。并由称得的体重计算得出小鼠的灌喂量。2.2 中药材提取物灌喂小鼠 本实验对两种中药材提取物进行试验，分别编号 A 药和 B 药。中药材提取物分为两种浓度：中剂量组药浓度为 0.66g/mL，高剂量组药浓度为2.00g/mL。A 药高浓度组、A 药中浓度组、B 药高浓度组、B 药中浓度组分别灌喂相应药物。正常对照组灌喂生理盐水。训练对照组不灌喂。每周灌喂 6 天，休息 1 天。小鼠灌喂方法：右手抓住小鼠尾巴，让其前爪抓在鼠笼上，左手拇指及食指捏住小鼠耳朵部位，中指及无名指小心捏住小鼠后背，小指压其尾巴；右手拿注射器从小鼠上颚靠小鼠后背食管缓慢插入灌喂针后并缓慢注入药物或生理盐水。注：千万要找准部位后再注入药物，很容易注入到气管中；插入注射器一定要轻缓，很容易伤到小鼠内部结构。2.3 小鼠负重游泳训练用塑料桶作为游泳池，水深约 35 cm，水温控制在 342范围内，每天换水，每组各一个游泳箱；首先将小鼠进行适应性游泳 2d，首次游泳 20min，1次/d；在小鼠尾部距离尾巴 2-3cm 处粘上医用胶布并开孔，然后根据小鼠当时体重用在胶布上挂 5%重量的回型针。每周游泳 6 天，休息 1 天。游泳结束后将胶布及回型针取下，用毛巾和纸巾将小鼠身上的水擦干后放于电暖气下烘烤，待完全干后放回笼中正常饲养，每天游泳一次，游泳时间每周递增，依次为： 5min、8 min、12 min、15 min。2.4 小鼠力竭游泳待小鼠负重游泳训练 4 周后，进行力竭游泳。将小鼠放于水迷宫中，水深约35 cm，水温控制在 342范围内。力竭判断标准为：以小鼠头部全部入水持续 8s 不能游出水面为判定终点。力竭游泳按组进行，纪录各组力竭游泳时间。2.5 样本采集与处理2.5.1 血液采集采用摘除眼球采血方法进行血液采集。方法如下：(1).小鼠力竭游泳后，摘除小鼠眼球采血。每只小鼠可取 1.52.0 mL血液；(2).3500 rpm 离心 15min;(3).取上清 4保存；预留一部分送医院作血常规检测。2.5.2 取脑血液采集后小心用镊子抛离颅骨后，取出脑后用锡纸包裹后放于 5mL 冻存管中并作好标记；每组预留 3 只小鼠的脑进行固定备用。2.5.3 脾脏、肝脏和股四头肌采集肝脏和股四头肌采集按此步骤进行：(1).将生理盐水预冷；(2).取出肝脏、脾脏及股四头肌后放入生理盐水中漂洗干净，去血液；(3).用滤纸吸干水分后，在电子天平上称重并纪录数据；(4).用锡纸包裹后低温冷冻保存。2.6 ROS、MDA、SOD、T-AOC、肝糖原及肌糖原含量测定ROS、MDA、SOD、T-AOC、肝糖原及肌糖原含量测定按照试剂盒说明书进行。2.7 血液生化指标将血清送往医院进行测定。2.8 小鼠抗缺氧能力测定小鼠分为三组：A 高浓度组、B 高浓度组及对照组。灌喂 5 周后将小鼠分组放入密封瓶中，并用保鲜膜进行密封。记录死亡时间。3. 结果3.1 小鼠体重称量每周用电子天平对小鼠体重进行称量一次，结果如表 3-1：表 3-1 小鼠体重原始数据时期 分组 体重（g） 平均A 高 16.4 23.0 17.8 13.0 17.6 A 中 20.5 18.8 19.7 20.2 19.8 B 高 16.4 21.2 15.7 14.7 17.0 B 中 18.5 15.0 13.6 13.5 15.2 C 17.7 17.1 17.1 13.9 16.5 第1周D 13.8 17.7 16.9 16.5 16.2 A 高 18.9 22.9 19.5 28.4 32.6 25.5 24.0 25.4 21.0 25.1 24.1 28.3 24.6 第2A 中 32.9 29.3 28.7 28.5 26.7 18.5 13.8 18.8 30.5 20.9 20.5 20.3 24.1 B 高 16.0 17.0 18.0 16.1 29.6 25.9 29.2 25.3 28.3 31.9 33.1 20.2 24.2 B 中 24.7 20.7 19.9 20.1 19.0 16.8 28.6 26.1 29.0 25.9 23.1 C 28.9 24.4 26.6 13.3 16.4 21.5 15.4 24.0 17.9 31.1 22.0 周D 22.0 22.1 21.6 29.5 30.5 28.5 25.1 25.5 27.8 23.7 24.5 24.3 25.4 A 高 24.2 25.8 24.1 33.3 24.6 25.8 28.2 27.5 29.0 27.8 27.2 27.0 A 中 30.7 33.3 28.1 27.5 31.6 23.9 17.4 22.8 26.5 25.3 26.7 B 高 26.8 29.7 29.9 26.3 33.1 29.5 36.1 20.6 23.0 21.7 27.7 B 中 28.2 29.6 24.9 26.4 26.7 22.9 25.1 25.2 22.1 25.7 C 31.9 26.9 23.9 26.7 30.2 21.3 23.6 24.3 19.9 25.4 第3周D 26.2 23.6 24.8 24.7 22.0 24.2 31.0 28.1 28.0 30.6 29.1 26.6 A 高 31.4 28.9 30.3 30.7 37.6 31.5 30.4 29.0 32.1 29.5 31.1 31.4 31.2 A 中 31.8 28.0 34.2 30.8 34.9 28.0 38.8 35.7 31.5 32.6 B 高 35.4 37.0 31.9 29.8 32.3 32.8 29.4 28.8 28.0 27.3 31.3 B 中 31.1 30.9 27.5 26.4 28.3 31.2 31.1 30.2 28.7 29.5 C 31.4 32.9 29.2 34.4 29.4 28.5 24.6 30.1 26.4 29.7 第4周D 30.2 27.7 32.9 32.5 36.3 35.1 32.3 33.9 34.6 34.0 32.1 32.9 A 高 33.1 32.5 33.4 32.1 30.0 29.6 31.9 33.4 32.5 31.4 32.3 30.6 31.9 A 中 30.2 34.1 35.8 32.4 30.1 36.1 31.2 36.8 33.3 33.3 B 高 31.6 31.2 32.3 34.1 34.3 36.6 31.3 28.2 33.4 28.3 30.4 32.4 32.0 B 中 39.2 32.9 30.4 30.1 28.7 32.3 C 27.2 32.5 30.1 27.8 33.4 32.8 31.4 33.1 31.0 第5周D 28.0 34.8 31.5 34.0 34.5 36.2 32.7 35.9 36.6 35.9 33.6 34.0 图 3-1 为利用 Graphpad Prism 数据分析图：图 3-1 小鼠第 1 周至第 5 周体重分析3.2 小鼠负重游泳至力竭时间待小鼠负重游泳训练 4 周后，进行力竭游泳各组时间统计如表 3-2：表 3-2 小鼠力竭游泳时间力竭游泳时间纪录（小数点前表示分钟，小数点后表示秒）分组 时间 平均 总数A 高 31.05 45.34 46.49 63.27 73.49 116.10 121.03 124.38 144.05 163.42 153.57 167.34 104.13 12 只A 中 18.20 24.19 28.24 31.37 33.57 44.00 45.15 48.30 65.32 37.59 9 只B 高 25.35 25.35 26.27 41.27 43.40 51.58 54.53 71.58 42.42 8 只B 中 27.30 36.41 40.00 44.30 48.39 48.59 88.10 91.40 92.23 107.43 62.42 10 只C 10.00 13.40 14.00 14.12 26.12 26.58 34.20 69.52 79.54 31.94 9 只D 11.14 14.23 24.00 30.37 33.46 33.48 34.21 46.44 50.50 59.22 83.14 38.20 11 只图 3-2 为利用 Graphpad Prism 数据分析图：图 3-2 小鼠力竭游泳时间分析3.3 ROS、MDA、SOD、T-AOC、肝糖原及肌糖原含量测定ROS、MDA、SOD、T-AOC、肝糖原及肌糖原含量测定原始数据见附表；图 3-3 为利用 Graphpad Prism 数据分析图：3.4 小鼠抗缺氧时间表 3-3 小鼠抗缺氧时间分组 小鼠抗缺氧时间（s） 平均（s）实验组 A 高 14.27 14.39 15.34 15.48 16.02 16.3 25.42 16.75 实验组 B 高 14.49 15.3 19.17 19.36 21.51 17.97 对照组 12.02 13.03 13.44 14.04 15.36 13.58 4. 讨论本实验室人员均是初次做该实验。所得到的数据未能达到预期效果。下面对本次实验失败的原因进行讨论以及为后续实验的一些建议：（1） 实验失败原因之一就是实验样本量太小，在适应性游泳过程中，原预定图 3-3 ROS、MDA、SOD、T-AOC、肝糖原及肌糖原含量A: 超氧化物歧化酶（SOD）分析 B: 丙二醛（MDA）分析 C: 肌糖原分析D: 总抗氧化能力（TAOC）分析 E: 肝糖原分析 F：活性氧（ROS）分析DA BCFE小鼠游泳 20min 时间过长，造成样本量减少；（2） 其次就是小鼠灌喂，刚开始灌喂方法不对，很可能将药物灌至小鼠气管中造成小鼠死亡，也有可能将灌喂针伸得太深导致小鼠内脏破裂后小鼠受伤，对实验结果造成影响。目前灌喂手法已经熟练掌握；（3） 力竭游泳时水温并没有严格控制在 342范围内，每组游泳仅靠感觉水温，很可能造成每组游泳温度不同造成力竭游泳时间差异，而这种差异并非由药物作用造成。建议对水温进行严格控制，毕竟水温对小鼠运动及体能机能影响不小；（4） 每组游泳完后应该对水迷宫清洗，更换温水后进行下一组鼠力竭游泳时间测量。上一组游泳后的水里含有的物质（如小鼠的粪便、小鼠掉的毛、无意中沾的垫料等）会对小鼠游泳造成影响。建议每组游泳完后应该对水迷宫清洗，更换温水；（5） 小鼠游泳时对小鼠负重没有严