模拟胆汁中磷脂酶A2催化反应影响因素的探究【说明书论文毕业】
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目 录摘 要 .Abstract.1 前 言 .11.1 胆结石 .11.1.1 胆结石成因 .11.1.2 胆固醇型胆结石 .11.2 模拟人体胆汁 .21.2.1 人体胆汁 .21.2.2 胆固醇、卵磷脂及胆盐 .31.2.3 胆结石形成机理的研究方法 .41.3 磷脂酶 A2.51.3.1 磷脂酶 A2的来源及分类生理功能 .51.3.2 磷脂酶 A2在胆结石形成中的作用 .51.3.3 酶活性的测定 .61.4 选题背景及意义 .72 实验部分 .82.1 实验试剂及仪器 .82.2 实验方法 .82.2.1 模型胆汁的配制 .82.2.2 溶液的配制 .102.2.3 在线检测游离脂肪酸 .102.2.4 模拟胆汁中 PLA2催化反应速率及相对活性的测定 .122.2.5 油酸标准曲线 .142.2.6 实验最佳条件的确定 .143 结果与讨论 .153.1 酚红浓度的影响 .15I3.2 温度对反应速率的影响 .153.3 缓冲液浓度对反应速率的影响 .163.4 酶浓度对反应速率的影响 .164 结 论 .18参考文献 .19致 谢 .21II模拟胆汁中磷脂酶 A2催化反应影响因素的探究摘 要随着人们生活水平提高，生活习惯改变，胆结石发病率逐渐上升且胆固醇结石比例增加。人体胆汁中含有卵磷脂而卵磷脂能溶解多余的胆固醇。改变卵磷脂的浓度就会破坏胆固醇的平衡状态，析出胆固醇，从而形成结石。四个因素影响胆固醇型结石的形成：胆汁中胆固醇过饱和、加速胆固醇成核-结晶、胆汁的蠕动性发生改变和肠道内的胆固醇浓度增加。磷脂酶A 2（PLA 2）分布在人体中并能使卵磷脂的二位酰基水解为溶血卵磷脂和游离脂肪酸，溶血卵磷脂解溶胆固醇的能力仅为卵磷脂的一半。游离脂肪酸有成核效应，因此磷脂酶A 2的活性对胆固醇结石的形成有很大的关系。本论文采用酚红在线分光光度法，对模拟胆汁中酚红浓度、缓冲对的浓度、酶浓度、反应的温度等对磷脂酶A 2催化水解卵磷脂反应速率的影响进行研究。关键词：卵磷脂、磷脂酶A 2、胆固醇、模拟胆汁IIIStudy on the factors influencing the catalytic reaction of phospholipase A2 in the bileAbstractWith the improvement of peoples living standard, the change of life habits , the incidence of gallstones gradually increased and the proportion of cholesterol stones increased. The human bile contains lecithin which can dissolve excess cholesterol. Changes in the concentration of lecithin will destroy the balance of cholesterol, cholesterol, and thus the formation of stones. Four factors affect the formation of cholesterol calculus: cholesterol in the bile is too saturated, accelerate cholesterol nucleation and crystallization, the motility of bile and increase the concentration of cholesterol in the intestine.Phospholipase A2 (PLA2) distribution in the human body and can make lecithin two acyl hydrolysis to hemolysis lecithin and free fatty acid, the ability of hemolysis lecithin solution cholesterol is only half of lecithin. Free fatty acids have a nuclear effect, so the activity of phospholipase A2 has a great relationship with the formation of cholesterol calculus.In this paper, using phenol red online spectrophotometric method, to study the influence on the reaction rate of phospholipase A2 hydrolysis of lecithin in model bile phenol red concentration, buffer to the concentration, enzyme concentration, reaction temperature.Keyword: Lecithin, phospholipase A2, cholesterol, simulated bile01 前 言1.1 胆结石1.1.1 胆结石成因胆结石的成因很多，主要有以下几种情况：1、过高的胆固醇含量。胆固醇以小颗粒、液体稳定形态存在于胆汁中，如果这种状态遭到破坏，极易产生胆结石。而胆固醇含量增多的原因有（1）转换功能器官发生了故障。（2）胆汁酸的排量减少。（3）人体自身因素以及生活习惯的差异1。2、存在大量没有结合的胆红素。未结合胆红素的生成是因为细菌在人体组织中形成大量B 葡萄糖醛酸酶，活性高于抑制物。而未结合胆红素难溶于水，与离子结合成核，从而形成结晶。3、核心物的作用。胆汁中的各种固态物质，包括各种细胞，成核离子以及其它杂乱成分都可结晶成核。1.1.2 胆固醇型结石在我国胆结石比较常见，发病诱因也越来越多，而胆结石的类型也主要是胆固醇型结石。形成胆固醇主要是下面三个方面的作用：（1）大量胆固醇导致平衡体系遭到破坏，从而在理论上造成成核结晶的条件。（2）抑制结晶与促进结晶成核的因子数量的改变，导致胆固醇在胆汁中的含量发生了变化。（3）胆囊运动发生了改变，导致胆汁在胆囊和胆管中滞留的时间产生了改变，进而影响了结晶 、沉淀的发生 2。1、胆固醇过饱和胆固醇形成结石是有一个过程的，我们可以把这个过程大致分成了三个阶段：（1）胆固醇在胆汁中的含量增加，形成过饱和溶液。（2）胆固醇形成一个核心并且沉积下来。（3）在这个沉积的核心上聚集更多的结晶不断地生长。怎样判断胆固醇是否饱和，这就需要一种辨别方法。胆固醇饱和指数（CSI）即CSI=n胆盐 ：n 磷脂 ，当CSI1，胆固醇大量存在于胆汁中，呈过饱和状态 3。胆盐浓度超出临界值时，多余的胆固醇溶解于胶束中。囊泡中含有丰富的磷脂，当胆盐浓度增大时，磷脂转移到混合胶束中，从而改变囊泡的形状。余下囊泡中，如果胆固醇比磷脂的量小，则囊泡呈稳定状态。反之变得不稳定，并且胆固醇会发生转移，移动到胆固醇含量较小的囊泡中。或者与相对较大的多层囊泡进行融合形成液晶，这些晶体性质不稳定，能形成扁平的单晶体，这就是成核过程。12、抑制结晶与促进结晶成核的因子数量改变在胆固醇成核形成单水晶的过程中，胆固醇有一个溶解区域，而这个区域又划分为两大区。一个是亚稳定区域，一个是不稳定区域。不稳定区域也就是上面我们所说的胆固醇过饱和直接析出单水晶体成核。而在胆固醇过饱和的亚稳定区域，要想生成单水晶体，必须加入促成核因子。然而胆汁中存在促-抗成核因子，它们之间的动态平衡会影响单水结晶(CMC)的形成速度。3、胆囊运动功能改变胆结石的形成不仅仅是上面所说的两种情况，胆囊的运动状态也会引发胆结石病症的发生。胆囊的病变导致的胆囊黏膜部分功能紊乱引发吸收与分泌出现障碍，胆囊运动受阻，最终的结果就是胆汁大量堆积在胆囊中形成胆结石。纯的胆囊粘液素，它可以从过饱和的胆固醇溶液中析出胆固醇晶体。因此，在胆结石病患者中往往他们身体中也含有大量的胆囊粘液素。这些多余的胆囊粘液素存在的成因有以下两个方面：（1）胆囊粘膜功能异常。(2) 胆囊收缩功能异常 4。1.2 模拟人体胆汁基于各种药品与仪器，按照事先确定的步骤来配制模拟人体胆汁。根据三角相图配制人体模拟胆汁。1.2.1 人体胆汁人体胆汁中含有97.6%的水，其余2.4%为固体成分，主要是Na +、K +、Ca 2+、Cl -、HCO 3- -等无机成分，少部分有机成分包括胆汁酸、脂肪酸、胆固醇、胆色素、卵磷脂和少量蛋白质。有机成分各组分与比例如下图1.1 5。胆汁味苦，粘稠且PH约7.4，呈弱碱性。胆汁中主要有机物为由胆固醇合成的胆汁酸和主要成分为胆红素的胆色素。血红蛋白降解为胆红素与肝内受体蛋白结合并在酶作用下转变为结合胆红素。2图 1.1 胆汁中的有机成分和其比例组成胆囊内存储的胆汁 75%由肝细胞生成，25%由胆管细胞生成，水占 96%-97%， PH 为 7.4。肝脏分泌的肝胆汁呈金黄色或橘棕色，水占 80%-86%，PH 为6.8。并且进入毛细血管。胆管分泌的胆囊胆汁呈暗褐色或棕绿色 PH 为 7.0-8.5。肝细胞和毛细胆管对某些物质进行转移，从而产生了渗透压，导致胆汁进行流动，形成胆汁流。胆汁的主要功效有：加快脂肪的吸收。胆汁酸和磷脂作为乳化剂，乳化脂肪成为脂肪粒，使酶与脂肪反应更全面;胆盐对各种酶之间的反应起到了促进作用，也可以很好的对脂肪酶进行保护。分解的脂肪更易被人体吸收。脂肪不溶于水，要使脂肪被小肠吸收，可使其与胆汁中的胆盐聚合。 中和作用。胆汁的PH约为7.4，可与进入小肠的胃酸进行中和 6。1.2.2 胆固醇、卵磷脂及胆盐一、胆固醇又称胆甾醇。是一种环戊烷多氢菲的衍生物，它的分子结构式如图1.2所示。人体中含有大量的胆固醇，是各种生物膜的重要组成部分。胆固醇可以在一系列作用下形成胆固醇型结石，是现在结石中最常见的一种结石。图1.2 胆固醇的分子结构式二、 卵磷脂（Lecithin），又叫做蛋黄素，三大营养素分别为蛋白质、维生素和卵磷脂，又名磷脂酰胆碱。是胆汁中的主要磷脂，分子式如图图1.3 卵磷脂的分子结构3卵磷脂在溶剂中存在的形式有单基、反胶束、单分子层、单层小泡囊、胶束、混合胶束、单层大泡囊和多层泡囊多种形式，见图1.4所示。多层囊泡 MLV 小型单层囊泡 SUV 大型单层囊泡 LUVMonome Mixed micelle Monolayer（单基） （混合胶束） （单分子层）Micelle Reversemecelle（胶束） （反胶囊）图 1.4 卵磷脂的存在形式三、胆盐的结构如图1.5图1.5 胆盐的分子结构41.2.3 胆结石形成机理的研究方法1动力学方法由于胆盐的改变，导致囊泡中磷脂的变化，经过一系列的相互作用与复杂的分子重排，从而形成简单胶束。而在形成简单胶束的过程中，也会转化一部分混合胶束。当胆盐浓度过大时，会使磷脂从囊泡中转移的混合胶束中，而剩余的囊泡部分，如果胆固醇含量较大，会形成多层囊泡，而这个囊泡会形成胆固醇单水晶体7。这就是胆固醇的结晶过程。动力学方法在人体胆汁及模拟胆汁中沉淀成核物质出现时开始测定时间规律方法。定义看胆汁中晶核形成的时间：为非结晶胆汁中第一次出现胆固醇结晶的时间。二热力学方法在模型胆汁达到热力学平衡状态后，研究胆固醇形成结石的方法为热力学方法。我们根据胆固醇从最初状态逐渐变为饱和状态绘制成胆固醇饱和曲线，从而研究胆结石病患与正常人胆汁存在的不同。热力学方法方法主要有：浊点法和饱和溶解法。1.3 磷脂酶A 21.3.1 磷脂酶A 2的来源及分类生理功能（一）磷脂酶A 2来源人类大多数细胞都含有磷脂酶A 2，主要分为两类：膜结合磷脂酶A 2、溶酶体和细胞中可溶性磷脂酶A 2。人体体液中的磷脂酶A 2主要来源是巨噬细胞、激活的单核细胞和中性粒细胞分泌物中。主要在人体中的存在为胰腺、涎腺、前列腺、精囊腺以及脑细胞膜、肝细胞膜、心肌细胞膜等各类生物细胞膜中，另外肾小球系膜细胞和肺泡中也含有磷脂酶A 2。而在人体发病的情况下，磷脂酶A 2主要存在于间质、血管间隙和关节腔中。(2)磷脂酶A 2分类可分为分泌型(PLA 2-和PLA 2-)和胞质型(PLA 2-和PLA 2-)两种。（三）磷脂酶A 2的生理功能磷脂酶A 2有多种分类并且其具有多种功能1、调节体内磷脂类物质的平衡2、调节动物新陈代谢51.3.2 磷脂酶A 2在胆结石形成中的作用磷脂酶A 2水解卵磷脂，产生溶血卵磷脂与游离脂肪酸。溶血卵磷脂溶解胆固醇的能力较卵磷脂弱，并且游离脂肪酸有成核效应。同时磷脂酶A 2还是一种限速酶，它会影响生物活性物质的生成速度。因此，磷脂酶A 2在胆结石的形成中有不可忽视的作用。1.3.3 酶活性的测定方法图 1.6 磷脂酶 A2水解卵磷脂示意图通过研究上述反应所生成的产物的浓度来研究磷脂酶A 2的活性，对于产物卵磷脂和游离脂肪酸浓度研究，可以反向算出磷脂酶A 2的水解速率。我们主要是研究游离脂肪酸的浓度，以其质子化反应所带来的酚醛变色来观察，最终在模拟胆汁体系中了解磷脂酶A 2的影响因素。多种方法用以研究磷磷脂酶A 2，下面我们来介绍分
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