t细胞表型及脾细胞分离

研究生实验一、 T细胞表型测定（一）二、小鼠脾细胞分离技术潍坊医学院免疫学教研室邸大林Tel： 2608468Email： 实验一、 T细胞表型测定（一）-免疫细胞的分离、细胞涂片、固定及保存原理：T细胞是一个复杂的，不均一的整体，根据其发育的不同阶段，表面标记以及功能，可将其分为不同的亚群。 T细胞介导细胞免疫应答，并且对 B细胞介导的体液免疫应答起到辅助和调节作用。 T细胞共有标志： CD3+为总细胞 T细胞特有标志： CD4+细胞为辅助细胞， CD8+细胞为杀伤细胞。T淋巴细胞表面标志正常 值 ： 正常人外周血中：CD3为 60% 80%； CD4为 35% 55%； CD8为 20% 30% CD4/CD8的正常 值约 1.4 2.0。 CD4 CD8 1.4： 免疫缺陷病，如艾滋病的比 值 常小于 0.5； 恶 性 肿 瘤； 再生障碍性 贫 血 ； 某些病毒感染。 CD4 CD8 2.0： 自身免疫性疾病，如 SLE、 类风 湿关 节 炎等。 T淋巴细胞表面标志的检测，有助于了解机体的细胞免疫功能，对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。SABC-AP法测定 T细胞亚群 SABC： 为链酶亲和素生物素， AP为碱性磷酸酶。 链酶亲和素： 是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量 60kD，每个分子由 4个亚基组成，可以和 4个生物素分子结合。亲和素与生物素一经结合就极为稳定，形成一种类似晶格的复合体。T cell待测 T细胞CD分子（？）一抗二抗底物实验基本流程实验材料 肝素、淋巴细胞分层液、 Hanks液、 PBS等； 一次性注射器、试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜，温箱等。 鼠抗人 CD3、 CD4、 CD8 单克隆抗体（ 1抗）；羊抗鼠 IgG（生物素化 2抗）； SABC-AP；底物（ BCIP/NBT 磷酸甲苯胺蓝盐）等。实验步骤 标本的制备：淋巴细胞悬液的制备 标本的染色： 结果的观察：标 本制 备 ：淋巴细胞悬液的制备（ 1）取肝素抗凝血 5ml与 5ml Hanks液稀释混匀，每组取 2ml，用滴管贴管壁轻轻叠加于 2ml分离液上，配平后 1500rpm离心10mins。（ 2）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的淋巴细胞，放入盛有 2ml Hanks液的试管， 1500rpm离心 10mins，弃上清，将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入 Hanks液重复洗涤一次，最后一次用 PBS洗涤。（ 3）弃去上清，淋巴细胞沉淀用 200lPBS溶解，取 20l细胞涂片，下一次实验检测 T细胞亚群用。标本染色 细胞涂片用记号笔划圈，滴固定液 1滴 ， 室温固定 2 3分钟。 滴加鼠抗人 CD3、 CD4、 CD8抗体 15L， 轻轻摇晃，使单抗均匀铺在细胞表面， 37 孵育 2 3h， PBS洗 3次。 滴加生物素标记羊抗小鼠抗体 15L ， 37 孵育 30 45分钟，PBS洗 3次。 滴加 SABC 15L ， 37 孵育 30 45分钟， PBS洗 3次。 滴加显色剂 30 50L ， 室温显色 20 40分钟。可在显微镜下观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用 PBS淋洗。 滴加细胞核复染液 1滴， 30秒后自来水淋洗。 显微镜下观察结果。注意事项： 以上操作中， 37 孵育时应将玻片置于湿盒中，切勿干片，特别是加底物后，干片将导致阴阳性结果不能分辨。 观察结果时应使涂片保持湿润。观察结果 高倍镜下计数 100 200个单个核细胞。计算阳性率。阳性细胞：细胞表面呈红色。 标准阳性： 细胞表面呈红色，可见深蓝色细胞核； 强阳性： 细胞周缘及中央均呈红色，看不见细胞核； 弱阳性： 细胞表面呈淡红色，可见淡兰色细胞核； 阴性细胞： 细胞表面无着色反应，呈淡兰色。注意事项： 为防止试剂受到污染，加样器吸头最好为一次性使用。 分离单个核细胞中，将稀释血液加于分层液上时，务必要使之形成良好的界面，否则影响分离结果。 孵育过程中，应将涂片置于湿盒中，操作中始终要注意保持涂片的湿润，以确保得到完美的实验结果。 淋洗时不要直接对着细胞冲，避免细胞脱落。 淋洗后，加试剂前须擦干细胞圈外水分，以免试剂流散。实验二 小鼠脾细胞分离与制备技术 分离小鼠脾细胞，细胞计数板进行细胞计数，胎盘蓝染色进行细胞活性检测。实验材料： 实验动物：小鼠。 细胞培养液。 试管，滴管，离心机，培养皿， 100目细胞筛等。 选择小鼠，拉脱颈椎处死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪开皮肤，打开腹腔。找到红色的脾脏，用镊子分离后摘除。 将脾脏放入盛有 5-10ml培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除脾脏周围的结缔组织。 将脾脏移入另一个盛有 5-10ml培养液的平皿中，轻轻漂洗后置于 100目细胞筛中，轻轻挤压使脾细胞通过筛孔进入培养液中，反复冲洗，以取得脾细胞悬液。1、分离小鼠脾细胞 收集分离出的脾细胞，置于 10ml离心管内加入培养液吹打，取 10l细胞，与 10l胎盘蓝染液混匀后染色并观察细胞活力，同时进行细胞计数。 细胞活力观察（台盼蓝染色）： 细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的 DNA 结合，被染成淡蓝色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，可以鉴别死细胞与活细胞。 细胞计数： 采用细胞计数板。2、细胞活力观察及计数 材料： 4%台盼蓝母液（称取 4g台盼蓝，加蒸馏水研磨，加双蒸水至 100ml，用滤纸过滤， 4 保存。使用时，用 PBS稀释至0.4%）、 血细胞计数板、显微镜等。 步骤： 制备单细胞悬液； 染色：取 10l细胞悬液与 10l台盼蓝溶液并混匀； 计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞。 注意事项： 台盼蓝对人体有毒，尽量避免直接接触。染色时间不宜过长，否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。台盼蓝 染色细胞计数： 步骤： 用乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干； 用微量移液器取少许细胞悬液（ 10l），将细胞样本从室的一个口注入，液体在室中扩散，空气从另一个口排除； 观察计数板四角大方格中的细胞数，并计算细胞浓度