血清碱性磷酸酶活性测定ppt课件VIP

血清 碱性磷酸酶 活性测定 磷酸苯二钠法1主要内容： 实验目的 实验原理 实验器材与试剂 实验操作 计算 临床意义 注意事项2 酶活力 ：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。底物减少量或生成物增加量酶促反应速度 =单位时间基本概念3实验目的实验目的掌握酶活力测定的一般方法掌握血清中 ALP活力测定方法与临床意义4思考思考 如何测定酶活力的大小 ？酶活力 ： 酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度的大小。酶促反应速度的大小。 酶促反应的速度：酶促反应的速度：常用 单位时间内底物的减少量或产物的生成量 来表示 。 5酶活力测定方法酶活力测定方法终止测定法（或定时法）：终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法本次实验的方法通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。均速度。 连续监测法：连续监测法：连续监测法是指每隔一定时间（连续监测法是指每隔一定时间（ 2 60s），连续多次测定酶反），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。速度，间接计算酶活性浓度的方法。 适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测目前已取代固定时间法而成为临床实验室测6碱性磷酸酶 （ ALP） 是一组在 碱性环境 中 水解磷酸酯 的酶类。来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常人血清中 ALP主要来源于 肝脏 。是一种能够将对应底物 去磷酸化 的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的 磷酸基团 除去，并生成 磷酸根离子和 自由的羟基 ，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。什么是什么是 ALP？7实验原理实验原理碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与 4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与 ALP活性成正比。磷酸苯二钠 +H2O 苯酚 +磷酸氢二钠苯酚 +4-氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物ALPpH=10铁氰化钾8试剂与仪器试剂与仪器器材：5ml移液管， 1ml移液管， 100或 200ul微量可调式移液器， 721E分光光度计， 1cm比色皿， 37 恒温水浴试剂：1 0.1mol/L碳酸盐缓冲液 (pH10.0) 无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠 3.36g， 4-氨基安替比林 1.5g，溶于800mL蒸馏水中，定容 至 1L。置棕色瓶中保存。2 20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入 磷酸苯二钠 2.18g(磷酸苯二钠如含 2分子结晶水，则应称取 2.54g) ，冷却后加氯仿 2ml防腐，在 4 冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）3显色液（铁氰化钾的硼酸溶液） 称取铁氰化钾2.5g，硼酸 17g，各自溶于蒸馏水 400ml中，两液混合后，加蒸馏水至 1L，置棕色瓶中避光保存 (如出现蓝绿色即弃去 )。4 酚标准工作液（ 0.05mg/ml） 购买合格的二级标准品。9实验操作实验操作取取 4支试管，如下操作：支试管，如下操作：立即混匀。用立即混匀。用 510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。零点，读取各管吸光度。*保持反应时温度是均衡的，保持反应时温度是均衡的， 37C 测定管测定管 标准管标准管 空白管空白管 对照管对照管血清（血清（ ml） 0.100 酚标准液酚标准液 0.100 蒸馏水蒸馏水 0.100 pH10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 1.00 1.00 1.00 1.00混匀，混匀， 37 水浴保温水浴保温 5min，同时将底物预热，同时将底物预热底物液底物液 1.00 1.00 1.00 1.00混匀，混匀， 37 水浴保护水浴保护 15min铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液 3.00 3.00 3.00 3.00血清血清 0.10010计算公式计算公式 :参考值参考值 :成人：成人： 313 Kings单位，单位， 儿童：儿童： 528Kings 单位单位。ALP 活力 = （ A测定 A对照 ）（ A标准 A空白 ） X0.05X 100（ kings单位）11临床意义临床意义在临床上，血清在临床上，血清 ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。辅助诊断指标。1. 血清血清 ALP活性升高活性升高 肝胆疾病肝胆疾病 ：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的度的 ALP释放进入血液中，引起血清释放进入血液中，引起血清 ALP活性增高，如纤维性活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等复愈合期等 。2. 血清血清 ALP活性降低活性降低 :比较少见，主要见于呆小症，重症慢性肾比较少见，主要见于呆小症，重症慢性肾炎、乳糜泻、炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。贫血、恶病质等。12注意事项注意事项 酚标准液开后不能久置。 底物液不能含有酚，若含酚则显 红色 ，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。 加入铁氰化钾后必须 迅速混匀 (为了改变 PH来终止酶促反应），否则有影响，偏大。 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用。此液应避光保存，如出现 蓝绿色 即作废 。13思考题思考题1. 本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？答：终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了 PH，使其不再处于最适 PH。2.B管与管与 C管在实验中有何作用管在实验中有何作用 ?不设两管有何影响？不设两管有何