动物细胞培养的生物学知识

云南大学生物技术系本科专业必修课程细胞工程云南大学生命科学学院林洁 主讲组成人及哺乳类动物机体的细胞具有极其复杂的结构和功能，细胞在机体内生长时相互依赖、相互制约，在神经体液的调节下形成了一种天然的内环境， 体外生长时脱离了这些内平衡系统 ，与机体内细胞相比不完全相同。细胞体外生长时，有其 特有的生长类型 、 特点 、过程 和 所需的生长条件 。第三章 动物细胞培养 的 生物学知识n 第一节 体外培养细胞的生长方式及类型n 第二节 体外培养细胞的生长特点n 第三节 体外培养细胞的生长和增殖过程n 第四节 体外培养细胞的生长条件n 第五节 体外培养细胞生长的监测方法第一节 体外培养细胞 的 生长方式和类型n 体外培养的动物细胞，按照其生长方式可以分为：q 1.贴壁生长型细胞（贴壁型细胞）q 2.悬浮生长型细胞（悬浮型细胞）1. 贴壁生长型细胞n 贴壁生长是大多数由机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。贴壁有两种含义 ：一是 细胞之间相互接触 ；二是 细胞与细胞外基质结合 。n 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞必须附着在固体表面生长， 当细胞布满表面后即停止生长 ，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满表面。而从生长表面脱落进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞培养称为 单层附壁培养 。n 贴壁生长型细胞的生长一般都经历 游离期 、 吸附期 、 繁殖期 和 退化期 。n 贴壁培养的细胞可用以蛋白酶、酸、碱等试剂或机械方法处理，使之从生长表面上脱落下来。1. 贴壁生长型细胞n 在体外，细胞的贴壁方式与体内也不相同 ，体外培养细胞 需要附着于某些 带适量正电荷 的固体或半固体表面，大多是只附着一个平面，因而体外培养的细胞的外形一般与在体内时明显不同。n 按照贴壁型细胞的体外培养时的形态，主要分为四大类：q 成纤维细胞型细胞q 上皮型细胞q 游走型细胞q 多形型细胞n 此型细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致 呈梭形 或 不规则形 。n 起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。n 人胚肺细胞在显微镜下观可观察到典型的成纤维细胞型。成纤维细胞型细胞n 此型细胞形状上类似上皮细胞，扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则偏平的多角形 ，中央有扁圆形核， 生长时彼此紧密连接成单层细胞 。n 起源于内胚层与外胚层的细胞在体外培养时都可能呈现上皮型。n 血管内皮细胞、 Hela宫颈癌细胞在显微镜下可呈现典型的上皮细胞型。上皮型细胞n 此型细胞具有类似巨噬细胞样的特征：在 支持物上分散生长 ，一般不连接成片、形成群落；细胞胞质常 伸出伪足和突起 ；在培养皿壁上 生长位置不固定 ，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则； 细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。n 表现此类细胞形态的主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞和肿瘤细胞。游走型细胞n 此型细胞形态上不规则，一般分为 胞体 和 胞突 两部分，其中胞突为细长形，类似丝状伪足；胞体虽然也略呈多角形，但没有成纤维细胞那样不规则。n 此类细胞不常见，只有某些神经组织细胞等那以确定其稳定形态的才归入多形细胞。多形型细胞n 上述四种细胞形态学形式是细胞体外培养最常见的、也是形态最明显的几种形式， 体外培养时所谓的某型细胞，仅是因为其形态与体内的某种细胞类似 ，而不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同，同时也不能说明培养细胞的起源。n 在实际培养中， 所培养的细胞并不一定呈现某一种典型的形态形式，而多呈现的是一些过渡性形态 。n 体外培养细胞的形态学特征受到多种培养条件的影响，因此， 细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标 ，不能用于确定某一培养物的确切细胞类型。重要提示2. 悬浮生长型细胞n 此类细胞在体外生长时 可在培养基中悬浮生长 ， 不必贴壁 ，因此也叫 非贴壁型细胞 。n 悬浮培养类似微生物的深层培养 。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易，易于大规模生产，便于过程的控制；大规模培养可采用培养微生物细胞用的发酵罐，但须将其稍加改进，如将搅拌速度减慢，搅拌叶改用螺旋桨式、通气装置通过硅橡胶管扩散的方式等。n 一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞，当接种于体外环境中，也可以以悬浮状态生长， 这类细胞的胞体始终为球形 。n 还有一些细胞，在体外培养时，即可贴壁生长，也可悬浮生长 。第二节 体外培养细胞 的 生长特点n 体外培养细胞重要的生长特点包括：q 1.贴附与伸展q 2.运动的接触抑制和生长的密度抑制1.贴附与伸展n 贴附并伸展是大多数体外培养细胞的基本生长特点，大多数的哺乳动物细胞在体外均附着于一定的底物而生长。 当培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样 ； 当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等n 在体外，细胞贴附的底物可以是其它 细胞 、 胶原 、 玻璃 或 塑料 等。一些促细胞附着因子 （例如 纤维连接蛋白 、 层粘连蛋白 、 血清扩展因子 、 III型胶原 等） 可以促进细胞与底物的附着 。n 一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长时期在悬浮中生长，除非是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。n 细胞的贴附与伸展受到 离子的作用 、 机械和物理因素 以及 生物因素 的影响。细胞贴附与伸展的步骤2.运动的接触抑制与生长的密度抑制n 接触抑制 是体外培养中多数贴壁型细胞的生长特性之一。n 一般情况下，正常细胞在不断分裂而增殖的过程中存在不停顿的活动或移动，其外周的细胞膜呈现一些特征性皱褶样活动，但是，当两个细胞移动而互相靠近时，其中之一或两个将停止移动并向另一方向离开，这保证了细胞将不会重叠。n 当贴壁细胞长满底物时，一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜皱褶样活动将停止，此即接触抑制。2.运动的接触抑制与生长的密度抑制n 一般来说，当细胞生长、汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，扁平形成的程度减小，与培养液接触的表面积减少；同时培养液中的一些营养物将逐渐消耗掉，尤其是细胞周围的部位，因此，这种 形成的单层细胞，其分裂将停止 ， 单层细胞的密度常与培养液中的血清浓度有关 ，这种贴壁细胞的体外生长特性被称为 细胞生长的密度抑制 （或 密度依赖性调节 ）n 形成密度抑制的单层细胞 可在静止状态维持存活一段时间 ，但 不发生分裂增殖 。n 转化细胞和恶性肿瘤细胞 与正常细胞不同，它们的 密度依赖性调节常常降低 ，因而可以生长成较高的终末细胞密度第三节 体外培养细胞 的 生长过程n 体外培养细胞的生长过程包括三个层次的概念：q 1. 细胞生长的全生命过程q 2. 每代细胞的生长过程q 3. 单个细胞的生长过程（细胞周期）1.细胞生长的全生命过程n 培养的细胞是生长在培养器皿之中的，当细胞持续生长繁殖一段时间后，到达一定的细胞密度之后，就应当将细胞分离成两部分或更多部分至新的培养器皿并补充更新培养液， 这一过程称为 传代 或 再培养。n 从动物体取出的原代培养的 原代细胞 ， 经过传代 以后，便 成为了细胞系 ，一般正常细胞的这种细胞系的 寿命只能维持一定的时间期限 （被称为有限细胞系），然后 将自行停止生长 ，即使提供足够的营养，最终仍致死亡 ，这个 完整的过程 ，被称为 细胞生长的全生命过程 ，也叫 细胞系的生长过程 。n 细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于 细胞来自何种动物种族 。在一些情况下， 培养的条件 也会在一定程度上影响细胞系的寿命。1.细胞生长的全生命过程n 在进行正常细胞培养时，无论 细胞的种类 和 供体的年龄 如何，在细胞的全生长过程中大致都要经过 三个主要阶段 ：q 原代培养或初代培养期 自体内取出在体外培养和第一次传代的时期，一般约 14周 。与体内相应的细胞性状相似。q 传代期 传代大约数天至 1周左右重复一次，持续数月，此期间细胞增殖旺盛。q 衰退（老）期 反复传代一定时间后（大概 30至 50代后），细胞增殖变慢，端粒进行性缩短，直至停止分裂。有的细胞的极少部分后来细胞能够转化，获得永生，成为 无限细胞系 。n 细胞系q 原代细胞经第一次传代后形成的能够继续进行传代培养的细胞群体称为细胞系，一般为有限细胞系。 n 原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为 连续细胞系 或 无限细胞系 。 n 细胞株q 从一个经生物学鉴定的细胞系 经过 克隆化或其他筛选方法 获得的 单一类型的细胞群体 被称为细胞株。 重要概念：细胞系 与 细胞株2.每代细胞的生长过程n 在体外培养的细胞的生长过程中，当细胞繁殖到一定密度后，将之分开并转移至新的培养皿中的（称之为 接种 ），使之继续繁殖生长，即为 传代 。n 细胞自接种至新的培养皿中至其下一次再传代接种的时间称为细胞的一代，每代细胞的生长过程可分为四个阶段：q I.滞留期（ 2496h）q II.指数生长期（ 35天）q III.平台期（传代时机）q IV.衰亡期第四节 体外培养细胞 的 生长条件n 体外培养的细胞需要合适的生长环境和必需的条件才能生存、繁殖。q 1. 无污染环境q 2.温度q 3. pHq 4.气体环境q 5.渗透压q 6.营养q 7.生长附着物q 8.抑制物1.无污染环境n 在细胞培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都非常敏感。因此， 培养环境的无污染是保证细胞生存的首要条件 ，培养环境的无污染主要包括： 无毒性物质污染 、 无微生物污染 和 无其他细胞污染。n 保证无污染的措施有 ：q 所有培养材料、器具要严格按照一定程序严格清洗，绝对保证无毒和洁净，使用前必须进行消毒处理；q 细胞培养过程中所需的气体、液体，均应去除细菌、病毒和支原体等各类污染物；q 所有操作过程都必须在洁净条件下进行。2.温度n 维持细胞增殖生长，必须有适宜的温度。人和哺乳动物培养细胞的标准温度为 36.5 0.5 ，若偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。n 总的说来， 培养细胞对低温的耐受力比对高温强 。q 高温 会使细胞内酶失活并破坏细胞膜上的脂类结构， 诱导细胞凋亡 。温度不超过 39 时，细胞代谢强度与温度成正比；超过 41 时，细胞受损；超过43 时，细胞死亡。q 低温 会降低细胞内酶的活性， 对细胞伤害不大 ；q 温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但如果向培养液中加一定量的 保护剂（如 DMSO、甘油 ），改变冰晶的性质， 装入 冻存管 保存于 液氮（温度可达 -196 ）中 ，能长期贮存，细胞解冻复苏后，仍能继续增殖生长，细胞的生物学性状不受任何影响，这是保存细胞的最主要手段。3.pHn 合适的 pH也是细胞生存的必要条件之一，不同细胞对 pH的要求不同， 哺乳动物细胞一般为 7.27.4之间 。n 一般来说，原代细胞对 pH变动的耐受差，而传代细胞或肿瘤细胞对pH变动的耐受较强。当 pH超出合适的范围，如低于 6或高于 7.6都会对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞蜕变或死亡。n 一般来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受。n 为保持培养环境的适宜的 pH条件，可采用的措施：q 在培养液中加入缓冲剂以稳定培养液的 pH；q 在开放式培养环境中，通入约 5%的 CO2，平衡培养过程中的 CO2流失。4.气体环境n 气体是细胞生存的必须条件之一，其主要包括 O2和 CO2 。n O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。不同的细胞和同一细胞的不同生长时期，对氧的需求各不相同。细胞培养环境中的溶氧要适度，溶氧过低会影响细胞的能力代谢，从而影响细胞的生长；反之， 溶氧过高是也会对细胞产生毒性 ，影响细胞的能量代谢。在 动物细胞培养过程中溶解氧一般控制在 5%80%。n CO2可以参与调节维持培养环境的 pH。5.渗透压n 渗透压对动物细胞也有影响。多数传代细胞，对渗透压有较强的耐受性，而原代细胞和正常二倍体细胞对渗透压波动则比较敏感。n 人血浆渗透压约 290mOsm/kg，为体外培养动物细胞的理想渗透压。不同细胞要求的渗透压略有不同，对大多数动物细胞来说， 渗透压在 260320mOsm/kg的范围内是较为适宜的 。n 常用的渗透压保护剂有： 三甲基甘氨酸 、 脯氨酸 和 甘氨酸 -甜菜碱等。6.营养n 动物细胞的体外培养对营养的要求较高，往往需要多种营养成分的优化组合：q 氨基酸 所有动物细胞都需要 12种基本氨基酸 （精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸）和 谷氨酰胺 。q 碳水化合物（糖类） 糖是细胞物质构成碳架的来源，并且能够为细胞生长代谢提供所需的能量。葡萄糖利用率最高。q 维生素 是维持细胞生长的生物活性物质，其中烟酰胺、叶酸、核黄素、维生素 B12、泛酸、吡哆醇及维生素 C是必不可少的。q 微量元素 细胞体外培养除需钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如铁、锌、硒等。q 生长因子 包括激素类物质和促生长因子，胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、神经生长因子