医学硕士答辩-欧琴答辩

EBV LMP2 B细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究温州医学院 2004级硕士学位论文答辩答辩人：欧 琴导 师：张丽芳 教授 夏克栋 教授专 业：病原生物学2007.5.17主 要 内 容 研究背景 研究目的 研究方案 结 果 分析与讨论 结 论研 究 背 景EB病毒 (Epstein-Barr virua,EBV)属于 疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症 (PTLD)、霍奇金病、 Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌 (NPC)。研 究 背 景肿瘤 亚型 EBV阳性率表 1 EBV相关的增生性疾病Burkitt淋巴瘤淋巴瘤 E-BL 100%S-BL 15%-85% AIDS-BL 100%NPC 低分化或未分化低分化或未分化 100霍奇金病霍奇金病 mc/ld 80%-90% ns 30T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤 fatal IM 100% AILD 40%淋巴母细胞瘤淋巴母细胞瘤 fatal IM 100%与器官移植相关与器官移植相关 100与与 AIDS相关相关 70 -80% 研 究 背 景 LMP2不是转化基因，维持 EBV潜伏感染。 LMP2成为 NPC等 EBV相关肿瘤治疗的理想 靶抗原之一。 研 究 背 景表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。研 究 背 景NPC患者血清中能检测 LMP2抗体。B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提供更充分的依据，以 B细胞表位为基础的多肽抗原可用于血清学检测。 研 究 目 的1. 预测 EBV LMP2的 B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。2. 分别构建含预测 B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用 6个组氨酸标签 (His.tag)表达表位融合蛋白，并用 Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。3. 将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性 IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测 NPC组、 CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为 B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在 NPC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。 研 究 方 案一、 EBV LMP2的二级结构分析和 B细胞表位预测研 究 方 案采用 EXPASY服务器提供的 SwissProt蛋白质数据库检索LMP2完整蛋白质的氨基酸序列 (/sprot/);采用 EXPASY服务器提供的 SOPMA、 GOR、 nnPredict、 HNN方法预测 LMP2二级结构 (http:/www.expasy.ch/tools) ；采用 EXPASY服务器提供的 SOSUI方法预测 LMP2跨膜区域(http:/www.expasy.ch/tools) ；采用 EXPASY服务器提供的 Hopp2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I;4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I图 5 重组质粒 pET32a/ozlf-69酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I;4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I图 6 重组质粒 pET32a/ozlf-71酶切鉴定1:DNA/Hind DNA Marker;2. pET32a/ozlf-71; 3:pET32a/ozlf-71/EcoR I;4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I重组质粒酶切鉴定结 果测序结果图 7 3个重组的目的基因的测序图结 果B细胞表位融合蛋白鉴定图 8 B细胞表位融合蛋白表达产物SDS-PAGE和 Western-Blot 分析1:蛋白分子标准物；2:IPTG诱导重组质粒 pET32a/ozlf-67蛋白表达；3:IPTG诱导重组质粒 pET32a/ozlf-69蛋白表达；4:IPTG诱导重组质粒 pET32a/ozlf-71蛋白表达；5:IPTG诱导重组质粒 pET32a蛋白表达；6: BL21结 果ozlf-67、 ozlf-69、 ozlf-71融合蛋白和 His蛋白的纯化图 9 纯化的 ozlf-67蛋白 SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3： Buffer B液滤液；4： Buffer C液 滤 液；5-7： Buffer E液 滤 液图 10 纯化的 ozlf-69蛋白 SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3： Buffer B液 滤 液；4： Buffer C液 滤 液；5-8： Buffer E液 滤 液图 11 纯化的 ozlf-71蛋白 SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3： Buffer B液滤液；4： Buffer C液滤