双向琼脂扩散试

双向琼脂扩散试验授课对象：临床医学专业八年制本科授课教员：汤玉瑜 授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室教学重点 琼脂的制备方法 双向琼脂扩散实验 的原理实验目的 掌握双向琼脂扩散试验的原理理解琼脂的制备方法了解双向琼脂扩散实验的应用 教学难点 如何根据沉淀线判断抗原或抗体的浓度使 用 教材 免疫学实验 第一版 朱道银 吴玉章 科学出版社 2008参 考 书 免疫学 第四版 龚非力 科学出版社 2007 Medical Immunology 10th， T.G.Parslow 推荐网站医学免疫学网络教学 1/mta/美国国立生物技术信息中心： 中国生物信息网： 概 述n 临床免疫检验技术 的出现最早可追溯至 19世纪末。 1896年， Widal发现在伤寒杆菌中加入伤寒病菌人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是 最早用于病原体感染诊断 的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验 (Widal test)。常见的免疫检验技术 ：n 经典的免疫学反应 凝集反应 沉淀反应 补体结合反应 中和反应n 免疫电泳技术n 免疫标记技术 免疫荧光 免疫酶技术 放射免疫测定 抗原抗体反应 （ antigen-antibody reaction）是抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。体外的抗原抗体反应表现为 沉淀 、 凝集、细胞溶解、补体结合、中和反应 等反应现象。兰德施泰纳， 1868年 -1943年，普林斯顿洛克菲勒医学研究所，发现人的主要血型系统而获1930年诺贝尔生理学或医学奖 。他最初研究化学 ,1896年後对血清学和免疫学产生兴趣 ,将化学 方法引入血清学研究 ,发现不同人的血清与血细胞混合後可发生凝集反应 ,1901年用抗 A血清和抗 B血清将血液分成 A B C(後称 O)三型。 n 沉淀反应 （ precipitation）是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。n 影响沉淀 反应的主要因素1.抗原、抗体反应的浓度、比例2.电解质3.温度4.酸碱度可溶性抗原 相应抗体+沉淀线或沉淀环分 类沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应琼脂扩散试验双向扩散单向扩散电泳技术火箭免疫电泳对流免疫电泳Question:n 怎样才能在无特殊仪器设备而又操作简便的定性检测血清中各种 免疫球蛋白 、 甲胎蛋白 、 乙肝 表面抗原等？实验原理可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的 琼脂糖凝胶 板的对应孔中各自向四周 自由扩散 ,若两者分子比例适当 ,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线 .n 沉淀物形成的主要原是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分 . n 免疫复合物的形成通常经过两步 :抗原与抗体的特异性结合 ;形成肉眼可见的免疫复合物晶格1.检测未知抗原或抗体2.抗原性质分析 3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定双向琼脂扩散试验的应用AgAbA B C D E F A: 浓度 Ag、 Ab及扩散率近似；B： 浓度 Ag、 Ab近似，扩散率 Ag Ab ；C： 浓度 Ag、 Ab近似，扩散率 Ag Ab ；D： 浓度 Ag Ab， 扩散率近似；E： 浓度 Ag Ab， 扩散率 Ag Ab ；F： 浓度 Ag Ab， 扩散率 Ag Ab ；1:待检 Ag 2:标准 Ag待检 Ag与标准抗原完全吻合待检 Ag中 含有与标准 Ag相同的 Ag； 还有另外的 Ag与 Ab相 对应待检 Ag有与 Ab相对应的 Ag,但与标准 Ag不同待检 Ag与标准 Ag性质相同；但含量较低 1.周围 6个孔放不同稀释度的相应 Ab。2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。3.可进行任意稀释。 “ 1” 为单一抗原抗体系统 。“ n” 为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。*可以用混合抗体鉴定抗原纯度 。单向免疫扩散将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。n 是一种 定量试验 ，一般是用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。n 应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中 IgG、 IgA 及 IgM的水平。1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找相应抗原浓度绘制标准曲线标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定影响因素1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长5.扩散温度： 4 37 内温度与扩散速度正相关实验材料1人血清 .2. 兔抗人 IgG 。3琼脂糖凝胶板， 1% 生理盐水。4其他：加样器、 3mm打孔器、模板、湿盒、恒温箱等。实验方法1琼脂板的制备 将载玻片置于水平台上，吸管吸取加热融化的 1%琼脂糖均匀浇在载玻片上，注意勿产生气泡。2. 打孔：待琼脂糖凝固后，将琼脂板至于图样上，用 3mm打孔器打孔，孔间距为 5mm(按模板进行 )，孔的排列方式如图所示。3 加样：于中央孔加入兔抗人 IgG，周围 1-4 孔加入倍比稀释不同浓度的人血清， 5孔加入 生理 盐水作对照。每孔各加 15l 。4将琼脂板平放于湿盒内，置 37 温箱中，分别于 24小时观察结果。实验结果判定n 观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验 1 至 4 孔（ 1:5、 1:10、 1:20、 1:40 的人抗兔 IgG）与中央孔 (人血清 )之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。 5孔是生理盐水，为阴性对照，与中间空间无白色沉淀线。n 免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。 结果分析沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。 结果分析n 抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。n 抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。 注意事项n 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。n 反