发酵法制γ-癸内酯

发酵法制 -癸内酯 -第五期大学生科研训练计划（ SRTP） 内容：1.-癸内酯1.1 什么是 -癸内酯 1.2 -癸内酯的制备方法1.3 -癸内酯的研究现状2.发酵法制 -癸内酯2.1 实验原理2.2 实验材料、试剂与仪器2.3 实验过程及方法2.4 实验结果2.5 数据分析与讨论3.结论及感想1. -癸内酯 1.1 什么是 -癸内酯 ？v 含有五元内酯环的十碳化合物v 分子量： 170.25；分子式： ；相对密度： 0 946；折光指数 n： 1 452；沸点 130 135 5mmHg；闪点 158 v 性质：无色淡黄色的略微粘稠的液体，不溶于水，可溶于乙醇、油脂v 天然存在于桃子、草莓、椰子、芒果、杏、啤酒、朗姆酒 ,也存在于乳制品的风味物质中 ,已在 120多种食物的香气成分中发现了这种化合物v -癸内酯具有强烈的果香和奶油香气 ,稀释时有桃子香气 1.2-癸内酯的制备方法：v 微生物发酵法：解脂假丝酵母菌v 化学合成方法：由烯烃作原料1.3- 癸内酯的现状 ：内酯类香料是香料家族中成员最少的一类，而且在自然界中存在很少，内酯类香料的香气一般较为高雅，适宜调配各种香精。内酯类与酯类在香气特征上有相似之处，即均具有突出的果香香气，广泛用于配制食用香精和日用香精，并用作合成香料、药物和农药的中间体以及聚合物和共聚物用溶剂等。 2.发酵法制 -癸内酯 2.1实验原理：蓖麻油酸甲酯合成 - 癸内酯：解脂假丝酵母菌 （ Yarrowia lipolytica AS2.1405），对于甘油酯和烷烃类物质有很强的代谢能力，是工业上应用较为广泛的一种菌种。蓖麻油来源丰富，且价格低廉，蓖麻油中含有的大量蓖麻油酸 (顺式 - 12- 羟基 - 十八碳 - 9- 烯酸 )是 - 癸内酯的转化前体，在转化过程中 R( )- 蓖麻油酸的手性中心传递到 - 癸内酯上，且蓖麻油同时也可作为微生物生长的碳源，是生物法制备天然香料 - 癸内酯的理想原料。通过改进发酵工艺，控制代谢途径等手段来提高 Yarrowia lipolytica AS2.1405代谢蓖麻油生物合成内酯的效率，使 - 癸内酯的发酵制备最终达到工业化生产要求，对于我国天然香料产业的发展有着巨大的推动作用。2.2实验材料、试剂与仪器：v 实验用菌株：解脂假丝酵母（ yarrowia lipolytica）v 主要实验试剂： -癸内酯标准品 、 酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、磷酸氢二钠、吐温 80、葡萄糖、蓖麻油v 主要实验仪器：无菌操作台、高压锅、气象色谱仪、阿贝折射仪、 HYG加回转式恒温调速药瓶柜、离心机实验中所需培养基的配制：种子培养基：v 葡萄糖 15.00g/lv 蛋白胨 2.50 g/lv 磷酸二氢钾 0.50 g/lv MgSO4.7H2O 2.40g/lv 磷酸氢二钠 1.20g/lv 吐温 80 4.00 g/lv 酵母膏 2.50 g/l发酵培养基：v 葡萄糖 15.00g/lv 蛋白胨 2.50 g/lv 磷酸二氢钾 0.50 g/lv MgSO4.7H2O 2.40g/lv 磷酸氢二钠 1.20g/lv 吐温 80 4.00 g/lv 蓖麻油 50.00 g/lv 酵母膏 2.50 g/l2.3实验过程及方法： .菌种培养：(1).配制培养基：v 配置菌种培养基 500ml， pH 调至 6.5。v 将菌种培养基 500ml分装于三个 150ml锥形瓶内，用棉花报纸封装好，标记 ，放置在高压锅内灭菌（ 121 ， 0.1mp,20 min）。v 将灭菌后的种子培养基置于 30 培养箱培养 24 h ，以便查看是否灭菌完全。(2).培养过程：v 24h后，观察培养基仍澄清、无浑浊现象，则未染菌，实验可继续进行。v 在无菌操作台上接种（准备工作：先开紫外线灯进行杀菌，一段时间后，关上紫外灯进行操作），用酒精进行消毒，在酒精灯外焰无菌区以一接种环的菌量接种至每 150ml种子培养基中 ,然后密封完全。v 将接种后的种子培养基培养在 HYG- 回转式恒温调速摇瓶柜（ 25 、 175 r/min ）中，培养 24 h。 .发酵培养：（ 1） .配制培养基：v 配置发酵培养基 500ml， pH调制 6.5。v 将发酵培养基 500ml分装于三个 150ml锥形瓶内，用棉花报纸封装好，标记 ，放置在高压锅内灭菌（ 121 ， 0.1mp,20 min）。v 将灭菌后的发酵培养基置于 30 培养箱培养 24 h ，以便查看是否灭菌完全。（ 2） .培养过程：v 24h后检查结果，培养基表面出现白色斑状物，说明染菌（原因是瓶口没封好，报纸有破损）照相同配方从新做一次，条件相同。v 发酵培养基澄清，无浑浊现象，说明未染菌可以继续使用。同时观察培养了 24h后的种子培养基发现溶液较浑浊，说明菌种生长较好，有一定数量的菌种产生。v 分别将 号瓶内的菌种培养基各 10ml加入到对应 号瓶的发酵培养基中，然后放置 HYG- 回转式恒温调速摇瓶柜中培养 48h（ 25， 175r/min）。（ 3） .实验结果：v 48小时后观察，发酵培养基发酵完全，表面无油状物，蓖麻油发酵完全，培养基呈乳白色，浑浊，打开后塞子后可以闻到明显的桃香味。 . -癸内酯的提取 :(两种提取方法 )(1).低速离心、萃取 (4500r/min,10min)(2).高速离心、萃取 (10000r/min,10min) .测定方法：(1).气象色谱检测法 :v 色谱柱 (Agilent 19091J-413 HP-5),毛细管色谱柱 ,柱长 15 m,内径 0.25 mm； v 载气 :氦气 ,压力 0.5 MPa； v 柱箱温度采用程序升温 :40 保持 1 min,以 6 / min 的速度升温至 160 ,保持 2 min,再以 8 /min 的速度升温至 230 并保持 20 min;进样口温度为 250 ;分流比 10： 1;进样体积 1.0 L v 检测器 :氢火焰离子检测器 (FID),检测器温度 250 。(2).阿贝折射仪检测 ：v 准备工作：阿贝折射仪、擦镜纸、擦镜液（无水乙醇 乙醚 =11各 20ml）、标品、样品v 相同条件下分别检测第一次离心所得液的上层油层和下层液体及第二次离心所得液的油层和下层液体的折光率，将所得数据进行比对 2.4实验结果：v 1.通过观察最后的发酵液，闻其气味，有很明显的桃香味，与标品 -癸内酯及相关文献的描述的气味相符，可初步判定发酵液中含有 -癸内酯。v 2.气相色谱检测结果：检测几次均无结果，由于仪器陈旧，不易点火等客观条件机器出现机械漂移，无法检测；之后负责老师陈老师分析主要原因为学校的气相色谱仪内的毛细管柱（ 5%苯基的甲基聚硅氧烷）为非极性，而我们实验条件毛细管柱应为极性，条件不一致，因为实验经费等客观条件，故放弃该方案。v 3.阿贝折射仪检测结果：v 标品折光率 n1=1.4510 v 样品： n2=1.4510 2.5数据分析与讨论：v 经分离提纯的 -癸内酯样品的折光率与标准品的折光率相等，可以定性检测到产品中含有 -癸内酯。3.结论及感想v 本实验主要涉及的研究方法是酵母菌的斜面培养、发酵培养，毛细管气相色谱条件测 - 癸内酯的含量及阿贝折射仪检测法定性分析等方法。v 目前生产 - 癸内的方法有化学合成和生物合成两种方法，本实验主要研究利用微生