基因工程原理第四章

第四章 载体载体 (Vector)n 为什么要有载体？外源 DNA转入宿主细胞后常常不能稳定复制n 载体是什么？可以在宿主细胞内稳定复制的 DNAn 载体实现稳定复制的方式1）作为独立的复制子进行复制质粒、噬菌体2）可以重组到宿主染色体 DNA进行复制真核载体：酵母、病毒第一节 大肠杆菌质粒载体质粒n 原核生物染色体外的稳定复制体 ,因此可利用作为克隆载体。有时，也泛指所有的环状载体DNA。n 质粒在琼脂糖电泳时，常呈三条带，迁移快慢从快到慢依次是：超螺旋、线性、开环。质粒的分类n 按是否携带促进细菌接合的转移基因 (tra基因 )，分为接合型和非接合型n 按在单个细胞内的拷贝数，分为松弛型 (多拷贝 )和严紧型 (低拷贝 )n 一般来说，接合型质粒相对分子量较大，拷贝数少；非接合型质粒分子量较小，拷贝数多质粒的复制起始决定质粒的拷贝数n 质粒具有两种调控起始的主要机制1)通过反义 RNA调控现在大部分质粒载体 (ori来自 ColE1质粒 )的拷贝数调控方式2)通过关键蛋白调控质粒克隆载体的理想特性n 相对分子量小 (易于操作、拷贝数高、利于出现单一酶切位点 )n 可以在宿主细胞内产生便于选择的表型特性 (便于筛选 )n 存在多种限制性酶的单一位点区域，且最好位于易测表型基因上 (便于克隆、筛选）pUC8载体n 衍生自 pBR322n 含有复制起始位点 (ori)和另两个基因：氨苄青霉素抗性基因和lacZ 基因Lac筛选 (蓝白斑筛选 )蓝白斑筛选：pUC质粒含 LacZ基因，该酶能分解生色底物 X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源 DNA插入 LacZ基因后失活，菌株呈白色，称之为蓝白斑筛选。pUC8等大肠杆菌质粒的缺点n 不能操作大于 10kb的 DNA片段n 大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复制体系，且重组 DNA分子在宿主细胞中丢失第二节 噬菌体基因组载体噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期n 为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。n 噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一起复制，称为溶源性感染周期。噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期噬菌体随意 DNA(optional DNA)n 噬菌体 基因组大小为48.5kb，其中有 15kb只在噬菌体 DNA整合到大肠杆菌染色体过程 (即溶源性感染周期 )中必须，该片段的删除不影响 噬菌体感染细菌的能力，也不影响裂解周期中新的 噬菌体颗粒合成，称为随意 DNA。噬菌体载体n 插入型载体 (insertion vector)，部分或全部随意 DNA被删除，并在删除后的基因组内部某位点引入单一的限制性酶切位点。n 替代型载体(replacement vector)，随意 DNA两侧引入限制性酶切位点，用需克隆的 DNA在连入时替代随意 DNA。cos位点与体外包装n cos位点， 噬菌体是一个线性分子，其两端具有 12个核苷酸、序列互补的单链突出。n cos位点处可发生连接形成串联体，当所插入片段大小合适时（连接产物大小在 37-52kb间 )，就会通过体外包装混合物而包装到衣壳内部。否则，就会被体外包装混合物切下，不被包装。第三节 其它载体其它载体n 用于连入更长 DNA片段n 用于特殊用途：1)得到单链 DNA2)RNA表达载体3)蛋白表达载体用于连入更长 DNA片段的载体n 基因组绘图与测序需要把更长 (18kb)的片段连入载体n 柯斯质粒 (cosmid)n Fosmidsn 噬菌体 P1载体系统 (bacteriophage P1 vector)n BAC(bacterial artificial chromosome)n PAC(P1-derived artificial chromosome)n YAC(Yeast artificial chromosome)n Mega-YAC用于连入更长 DNA片段的载体Cosmid与 Fosmidsn Cosmid1) 具有 cos位点的质粒，质粒大小 5-8kb2) 具有和 噬菌体一样的感染性3) 进入细胞后不能指导合成新的噬菌体颗粒，而是如质粒一样复制，因此重组 DNA可以从克隆而不是噬菌斑中得到n Fosmids包含了 F质粒的复制起始位点和载体 cos位点。与 Cosmid相似，但拷贝数较低酵母人工染色体 (YAC)n 在酵母中繁殖，是以染色体为根据。n 真核染色体的三个重要组件1) 着丝粒2) 端粒3) 一个或多个复制起始点YAC载体工作原理YAC的优点与缺点n 优点：天然酵母染色体大小为 230-1700kb,因此能插入上至 Mb的片段n 缺点：插入不稳定，克隆的 DNA会存在重排现象，形成新的序列组合。BACn BAC是基于大肠杆菌F质粒构建的。细菌F质粒是一种较大的质粒，具有插入较大片段的能力，可以克隆 300kb及更长的片段，且插入片段很稳定。噬菌体 P1载体系统与 PACn 噬菌体 P1载体系统与 载体类似，但是基因组更大 ，具有插入更大片段的能力，可以克隆 125kb的片段。n PAC综合了 P1载体系统和 BAC的特点，具有克隆长达 300kb片段的容量。用于特殊用途的载体n 用于特殊用途：1)得到单链 DNA2)得到 RNA探针和双链 RNA3)蛋白质表达载体a)最大量合成蛋白b)简化蛋白纯化c)促进蛋白溶解d)促进蛋白外运用于得到单链 DNA的载体n DNA测序、 S1核酸酶作图、寡核苷酸诱变等分子生物学操作需要得到单链 DNAn M13载体表达载体n 用于表达 RNA和大量蛋白的载体n 载体启动子经过优