实时荧光定量pcr技术,原理,应用及实践,第二代染料

Real-time PCR基因表达定量北京康为世纪生物技术有限公司2北京康为世纪生物科技有限公司 康为的目标：成为中国的 Invitrogen 完善的产品线 一站式的服务平台 您的问题解决专家！3北京康为世纪生物科技有限公司分子分子生物学生物学核酸提取PCR、 RT-PCR 及荧光定量 PCRDNA 分子量标准克隆与转化蛋白质蛋白质 学相关学相关蛋白提取与纯化蛋白定量、蛋白 Marker及蛋白电泳产品Western Blot产品免疫学免疫学相关相关免疫组化产品标签抗体内参抗体二抗完善的产品线4五大平台 一站式服务康为世纪生物科技有限公司5完善的产品线分子生物学全系列产品蛋白质学产品免疫学相关产品一站式服务平台实验设计平台分子生物学平台蛋白表达与纯化平台抗体制备纯化平台免疫学检测平台北京康为世纪生物科技有限公司我们的客户我们的合作伙伴北京大学、清华大学、复旦大学中国科学院、军事医学科学院301医院、协和医院、上海瑞金医院华大基因、诺华制药Real-time PCR基因表达定量北京康为世纪生物技术有限公司PCR： 国王和象棋的故事N = 264 -1 = 18446744070309551615PCR：伟大的天才发明 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrologyPCR：理想与现实l 反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能l 终点检测，与看家基因对照，所谓 半定量 ：不可接受。确定模板初始数量real-time使 qPCR成为可能q模板 DNA量越多， 荧光强度达到检测域值所需的循环数 越少，即 Ct值越小q模板 Log浓度与 Ct值呈线性关系Real-time PCR 应用 定量 基因表达水平检测 定量 基因拷贝数检测 多色标记 SNP检测 高精度溶解曲线分析（ HRM） - SNP 高精度溶解曲线分析（ HRM） - DNA甲基化分析Real-time PCR: 发光原理 非特异染料（ SYBR Green，SuperGreen） 水解探针（ TaqMan 探针） 非水解探针（ Molecular beacon ， Scorpion primer）染料法 qPCR基因表达水平检测 内参基因 (housekeeping gene)选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR墨菲定律： Anything can go wrong that will go wrong!以各自样本中内参（ housekeeping）基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度- Ct法 成立条件：内参基因 (houskeeping gene) 在相互比较的样本之间表达丰度相同 满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近 - 正负10%染料法 qPCR相对定量Housekeeping gene selectionHousekeeping gene 的概念与定义不同环境，不同生长与病理状态，不同器官、组织、细胞类型之间表达水平恒定-Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels. Thorax 2002;57:765-770 Housekeeping gene selectionEvidence Based Selection of Housekeeping Genes PLoS ONE. 2007; 2(9): e898Housekeeping gene selection文献检索，挑选恰当 housekeeping gene恰当：有文献表明某基因在给定研究条件下适合用作Housekeeping gene没有文献表明某基因在给定研究条件下不适合用作 Housekeeping gene （特别是 -Actin 和 GAPDH ）Housekeeping gene在给定研究条件下的表达丰度最好与目标基因相似通过实验选择 Housekeeping gene实测多个备选 Housekeeping gene以各备选基因的几何平均数为均一化标准，检验各基因在给定条件下的表达稳定性参考资料 geNorm 网站 - http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/ Vandesompele et al., Genome Biology, 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genesHousekeeping gene selectionHousekeeping gene 康为产品高丰度 ACTB， GAPDH中等丰度 beta2M低丰度 HPRT1染料法 qPCR基因表达水平检测 内参基因选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR样本处理与 RNA提取 外界刺激 10分钟 可检测的表达改变 严格平行操作。样品离开定义环境 2分钟内 裂解、固定细胞Trizon 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS）液氮RNA保存液 小心 DNA污染！使用 DNase 以 RNA作 PCR阴性对照CW0580CW0592染料法 qPCR基因表达水平检测 内参基因选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR逆转录逆转录引物选择下游应用：是否检测其它基因？检测何种剪接体？是否会有二级结构干扰？ 检测灵敏度是否足够？ Abundant RNA的干扰： mRNA or total RNA？一步法 or 两步法？两步法： 步骤多但灵活多样。 cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。推荐：工作的初期阶段RealSYBR 二步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROXRealSYBR 一步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROXRealSuper 二步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROX一步法： 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。推荐：工作的成熟阶段RealSuper 一步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROX染料法 qPCR基因表达水平检测 内参基因选择 样本处理与 RNA提取 cDNA qPCR反应条件优化Housekeeping gene单一特异性产物反应效率大于 90%反应条件优化目的基因 单一特异性产物 反应效率接近 housekeeping gene 反应效率尽量高Real-time PCR 总原则与普通 PCR相同 避免引物二聚体，避免二级结构 尽量小些 （ 70 - 300bp) 目标区段位置：考虑目标剪接体 推荐做跨 intron设计EXON 1 EXON 2INTRON 2 DNAEXON 1 EXON 2 RNA引物设计反应条件优化Master mix的选择 DNA聚合酶 Primers Dye Buffer and dNTPs TemplateCWBIO Real-time PCR系列产品 Mast