氨基酸发酵生产的研究进展

氨基酸的研究进展摘要 由于氨基酸在食品、饲料、医药、农业和日用化工等方面有极其广泛的用途,尤其随着抗癌药物制剂、氨基酸输液制剂及甜味二肽生产的飞速发展, 对原料氨基酸的需求量日益增长。传统的发酵工业越来越不能满足需求,势必被以基因工程为基础的新兴发酵工业所代替。通过对发酵法生产氨基酸的历史进行回顾, 及对未来前景作出展望,指出了运用 DNA 重组、定向突变等手段,对代谢途径及关键酶进行了深入系统的研究的必要性。关键词 发酵法 氨基酸生产 基因工程3. 1 载体- 受体系统及克隆表达的研究3. 1. 1 受体的获得目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌 K-12 及棒状杆菌家族, 通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。大肠杆菌遗传背景研究得清楚,载体系统完善, 利于工程菌的构建, 但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外,为应用带来困难。棒状杆菌能克服这两个缺点,但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍,所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。有报道表明,可通过给目的基因加上前导肽 ,使蛋白产物分泌至胞外;可对受体菌加热处理,暂时抑制其限制修饰系统1。3. 1. 2 载体的构建有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点,这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得2;载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点,可从常用的克隆载体中获得。在此基础上,引入 tacP /lacIQ 系统,得到能靠 IPTG 浓度来调节基因表达的载体;为了利于寻找有启动子活性的序列,引入 lacZ 基因, 构建了启动子探测载体3;通过引入 mob 基因,得到了可移动载体, 可将携带的外源基因以同源重组的方式与染色体整合4。3. 1. 3 基因转移手段由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌,CaCl2 转化法对它不适用,通常采用的方法有:原生质体转化、转导,电转化, 接合转移。原生质体转化的方法是较早采用的方法,由于受到原生质体再生条件的局限,效率不高;电转化方法由于高效 ,快速被广泛使用, 目前它的转化效率可达到原生质体转化法的 1001000 倍5。接合转移这种传统的重组方法近年来由于可移动载体的应用而发展,可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移,并且可将外源基因整合于染色体上 ,易于稳定遗传6 。3. 2 氨基酸生物合成途径的研究想要培育出某种氨基酸的产生菌,首先要了解这种氨基酸的生物合成途径、关键酶的反馈调控机制,考虑解除的方法,从而设计正确的育种方案。3. 2. 1 共同途径代谢途径可分为共同途径和分支途径。共同途径为分支途径提供前体物质。对共同途径的研究的焦点在于代谢过程的关键分支点。根据现有的研究资料,EP 是各个酶系统竞争的对象7。丙酮酸激酶将 PEP 转化为丙酮酸, PEP 羧化酶、PEP羧激酶将 PEP 和 CO2 转化为草酰乙酸 ;DAHP 合成酶将 PEP 与 4-磷酸赤藓糖合成DAHP。目前对代谢途径的研究,主要是通过插入法取代某些基因,或使酶基因失活, 从而研究基因产物的功能。Gulber 等在研究 PYK 的功能时 ,根据其 N 端序列合成 PCR引物,扩增得到 PYK 基因内部片段,用可移动质粒 PSU301 导入棒杆菌中同源重组,得到 PYK 突变体,来研究 PYK 基因的功能。3. 2. 2 分支途径分支途径通过若干个酶系,将共同的前体物质转化为不同的氨基酸。途径的研究热点在于关键酶的克隆与调控。参与氨基酸发酵的关键酶主要有 12 个,每个分支途径都有一到数个关键酶,生物合成的途径越长,关键酶的数目越多。关键酶中有的是变构酶,有的是同功酶,也有的多功能酶, 它们在于由同一前体出发去合成多种氨基酸的关键点上。目前,许多关键酶的基因已被克隆 :Ozaki 等克隆了谷氨酸棒杆菌的分支酸变位酶和预苯酸脱水酶基因,通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌 ,产量提高了 50%8。Katsumata 克隆了谷氨酸棒杆菌的阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因,使色氨酸的产量提高了 54%9。3. 3 酶调控方面进展3. 3. 1 酶量的调控酶量的调控也可视为酶基因转录的调控,在产氨基酸途径上的关键酶的表达 ,受到调节基因产物与代谢终产物的共同影响。诱导物利于酶在浓度高时的合成,而阻遏物抑制酶的合成。Yang 等对 TyrR 基因的研究表明,它是一个调节基因,调控着大肠杆菌中 8 个转录单位的21氨基酸和生物资源阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。这样,几乎所有的氨基酸都能生产出来。随着重组 DNA 技术的发展 ,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。70 年代末至 80 年代初期,随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。2. 1 用野生株的方法这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。典型的例子就是谷氨酸发酵。此外,改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度,使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵的例子。2. 2 用营养缺陷变异株的方法这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体,使生物合成在中途停止,不让最终产物起控制作用。这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵,有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵,还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。2. 3 类似物抗性变异株的方法在微生物体内,具有限制过量氨基酸生成的调节机制。因此 ,一般很难如愿获得要的氨基酸。为此,用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内, 使其发生控制作用, 从而抑制微生物的生长。这样,就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株,而这种变异株正是解除了调控机制的 ,能够生成过量的氨基酸利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。2. 4 体内及体外基因重组的方法基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。其中,体内基因重组是在自然界中所观察到的现象,在应用上又称为杂交育种 ,主要方法包括:转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等,这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体,在两条 DNA 链之间引起两次以上的交叉 ,是遗传性重组现象。通过体内基因重组技术的应用,易于组合遗传特性,能较为有效地育种。上述方法中开始实际应用的是细胞融合技术和转导技术,前者的实例有用短杆菌的苏氨酸、赖氨酸等发酵产生菌的育种;后者的例子是用大肠杆菌的色氨酸,沙门氏菌的亮氨酸 ,沙雷氏菌的组氨酸、精氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等发酵产生菌的育种。细胞内基因重组技术的缺点是, 现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。在 1979 年, 苏联人先成功地利用体外构建重组质粒的基因工程方法选育了苏氨酸产生菌,进行工业产苏氨酸,开创了氨基酸发酵工业的新纪元。近几年来, 将基因工程技术应用于代谢工程中的研究越来越深入,代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上 ,应用重组 DNA 技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与管径构建新的代谢网络,其主要步骤为:鉴定目标代谢途径涉及的酶 (特别是限速酶);取得酶基因必要时可用蛋白质工程技术,如定点诱变 ,基因剪接等,使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等); 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物;使调节元件的作用及培育条件最优化,这样则可以得到性能优良的氨基酸生产菌株。以下将较为详尽地对氨基酸基因工程菌的研究进展加以阐述。3 氨基酸基因工程菌的研究进展基因工程技术应用于发酵工程,使发酵工业呈现欣欣向荣的景象。发酵工业中基因工程的研究虽然起步较晚,但已取得成效,通过基因突变和重组,已选育了大批优良菌侏,不仅提高了传统产品的产量,而且开发了新产品,然而道路是艰辛的。因为代谢途径工程比蛋白多肽的基因工程复杂得多,它涉及的基因通常不止一个,除了需要有效的载体受体系统外,对代谢途径及调控机理的研究也十分重要 ,通过多年的努力,人们在上述的研究结果的基础上,提出了构建工程菌的一些策略。20刘云等 氨基酸发酵生产的研究进展1 氨基酸的用途及国内外生产现状氨基酸是构成蛋白质的基本单位,广泛应用于医药、食品及其调味剂、动物饲料、化妆品的制造。例如多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调;谷氨酸钠和甘氨酸可用做调味剂。甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料;苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品 1981 年获 FDA 批准,现在每年产量已达数万吨。苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。此外,一些氨基酸还是制做牙膏和香波等原料。目前 ,国内虽有不少生产氨基酸的厂家,但由于工艺技术滞后,产品质量及其成本都难以参与国际竞争。随着对氨基酸需求量的大大增加,国内的氨基酸生产水平远远不能满足要求。传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂, 难以达到工业化生产的目的。生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。工艺主要是用微生物直接发酵,成本低, 产量高。我国的谷氨酸钠(味精)产量居世界首位,赖氨酸产量也居世界前列。苏氨酸产量由于引进苏联的生产菌种,有了很大的提高。国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。在 80 年代中后期, 我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品, 1991 年销售量为二千万瓶, 1996 年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特, 但生产原料都依赖进口。据专家估计,到 2000 年,世界氨基酸产值可达 45 亿美元 ,占生物技术市场的 7%,国内的氨基酸产值可达 40 亿元,占全国发酵产业总产值的 12%2 氨基酸发酵生产发展的历史回顾所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。这些方法成立的一个重要原因是使用选育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。菌株的育种起初是由从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件开始的 ,从自然界或研究室保藏种类是有限的。而后在确立突变技术和19氨基酸和生物资源 Am inoAcids& Biotic Resources 1999, 21(4): 1923 收稿日期: 19990825 转录,其产物为 5. 3 万 Da的蛋白,与 Cro,CI 和中的 -helix-bend-helix 结构相似, 可与 DNA 的连续两个大沟相互补,它在溶液中以单体状态存在,当有一定量的芳香族氨基酸存在时,可与TyrR 蛋白结合 ,使之自体结合为六聚体 ,从而调节芳香族氨基酸合成中关键酶基因的转录10 。它一方面可做为阻遏物, aroF-tyrA, tyrP, tyrB, aroP 均可被 tyrR 和 tyr复合物抑制,另一方面, 对于 trp,m tr 两个基因的转录 ,又可充当激活物11。TyrR基因产物对转录的调控作用,目前是芳香族氨基酸基因工程研究的热点。3. 3. 2 酶活性的调节酶的活性可受到代谢物的抑制,在达到一定浓度时,代谢产物可结合于酶上,酶由活性态聚合为无活性的复合物。1992 年, Jennifer 用定点突变的方法证明 Trp-338 位点的突变可改变 CMPD 酶与 Phe 的结合,在 Phe 的浓度较高时,CMPD 酶也不从有活性的二聚体形成转变为四聚体或八聚体的无活性态12。随着 x-衍射、核磁共振技术在酶的结构、功能关系研究中的应用,这方面的研究将会有更大的进展。4 展望综上所述,由于氨基酸的广泛应用和生产的巨大社会经济效益, 以及氨基酸生理作用的不可取代性,也不会因社会技术的进步而被更迭和淘汰 ,是推动氨基酸生产技术不断进步的根本动力。应用重组 DNA 技术生产氨基酸的发酵工业方兴未艾。在对大肠杆菌载体-受体系统广泛而深入研究的基础上,对棒状杆菌家族的遗传背景、代谢途径以及载体-受体系统的研究也取得了长足进展,