汗腺三维重构模型中egfr的作用

汗腺三维重构模型中 EGFR 的作用外泌汗腺的主要功能是泌汗，排汗是人类调节体温的重要方式。严重大面积深度烧（创）伤愈合后，由于大部分汗腺毁损，机体散热调节体温能力下降，在盛夏季节，患者多感闷热、瘙痒等全身不适，严重影响了患者的身心健康与生活质量 1。 为了解决汗腺的修复与再生，学者们从不同的途径对汗腺的发育、修复与再生进行了研究，也取得了一定的进展 2, 3。我们先前对骨髓间充质干细胞（MSCs ）转分化为汗腺细胞的研究显示，MSCs 在一定条件下可以转分化汗腺，转分化来的汗腺细胞表达泌汗相关功能蛋白，并且能够促进汗腺功能的修复。但 MSCs 在体内的低转分化率（约 0.51）与 MSCs 促进汗腺功能恢复的结果并不十分吻合，我们进一步研究发现，大鼠足垫汗腺组织 BrdU 标记滞留细胞明显高于表皮基底层的 BrdU 标记滞留细胞，这一公认的表皮干细胞位点 4。我们推测除了转分化作用，MSCs 的旁分泌效应促进汗腺内源干细胞激活在 MSCs 促进汗腺功能恢复中起着重要作用 5。既然汗腺细胞具有丰富的干细胞来源，利用汗腺自身的细胞促进汗腺的修复与再生可能会是更直接、有效的途径。既往对汗腺损伤修复和再生的体外研究，多建立在单层组织细胞培养技术（2D）基础上，单层培养的组织细胞，能够快速分裂增殖，但细胞在体外改变的环境下增生，逐渐丧失了原有的性状，同时调控细胞增殖、代谢、分化和死亡的重要信号丧失，而这些信号负责形成组织特异性结构和功能，因此，在很多情况下，单层细胞组织培养技术所得到的研究结果和体内的情况并不符合 6-8。在生命科学和医学科学研究领域，我们更关注的是体外培养的组织细胞能否模拟体内组织细胞的性状。三维培养模式（3D），是与生理相关的培养模式，在此模式系统中生长的细胞能形成更高级的结构，表现出更生理的表型、相互作用及反应，因此，三维培养模式捕获了建立和维持组织具体形态发生过程中动态和交互信号的关键方面，开辟了一系列新的细胞反应和可能 6-8。三维培养细胞技术的先行者Bissell 利用细胞外基质（ECM）matrigel 成功地构建了乳腺癌上皮细胞的组织培养模型，利用乳腺癌的三维模型，他们在乳腺癌的形成、作用机制和药物治疗方面取得了重大进展 7-10。参照Bissell 的方法并对其进行改进，我们构建了汗腺细胞的三维培养模型，我们的2研究显示：体内/外情况下，汗腺细胞在细胞外基质中可以形成具有腔的单层或复层管状结构；有基底膜形成；表达汗腺的系列标志抗原、泌汗相关的功能蛋白，与细胞功能密切相关的细胞连接蛋白，表明在细胞外基质中重构的汗腺三维结构类似于在体汗腺的结构和功能 11 (图 1)。该模型对于进一步研究汗腺重建的分子机制具有重要的作用。图 1 重构汗腺与在体汗腺的对比研究受体酪氨酸激酶（RTK）是最大的一类细胞表面受体，由细胞外结构域、单次跨膜的疏水 螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶活性的细胞内结构域三部分组成。受体酪氨酸激酶决定各种细胞功能，如细胞增殖、分化、存活、迁移和凋亡 12, 13。受体酪氨酸激酶的 EGFR 家族是正常细胞发育和功能的关键调节子，以及各种病理生理现象的关键作用者 14-22：对胎儿皮肤及附属器发育的研究显示：发育早期的胎儿皮肤中, EGFR 基因表达较弱，随着胎龄的增长，特别在皮肤汗腺诱导形成阶段，EGFR 基因表达量增加最明显；在胎儿皮肤及附属器发育完成后，表达量增加缓慢 14, 15。成熟汗腺的导管部腔细胞膜和胞浆有无活性的 EGFR；分泌部细胞和导管部细胞的细胞核有活化的 EGFR 表达 16, 17。先天性外胚层发育不良综合征（一组外胚层发育缺损的先天性疾患，累及皮肤及其附属）患者的上皮细胞 EGFR mRNA 和有免疫活性的 EGFR 蛋白减少 18。通过同源重组灭活 EGFR 导致小鼠在孕期或出生时死亡，或者仅能存活 820天。出生后存活的小鼠存在上皮性器官，如皮肤、肺和胃肠道的发育受损。EGFR 敲除小鼠模型显示，从胚胎植入到出生后的发育存在广泛的发育缺陷，表明 EGFR 信号通路参与各种发育事件 19。鸟类和哺乳类耳蜗的再生性增生需要 EGFR 信号通路， EGFR 信号通路通过下调细胞周期抑制剂 p27(Kip1)使细3胞重新进入细胞周期 20。EGFR 的过表达，与汗腺肿瘤及其它上皮性肿瘤密切相关 21, 22。本项目的预实验显示：重构的汗腺三维结构表达 EGFR；当在汗腺培养基中加入 EGFR 特异性酪氨酸激酶抑制剂 AG1478，浓度大于0.5mol/L，汗腺细胞在细胞外基质中不能形成三维结构，呈单个散在细胞，表明 EGFR 在汗腺三维结构的形成中起着重要作用。综上所述，我们提出以下假说：EGFR 是细胞外基质诱导汗腺细胞重构汗腺三维模型的核心成份。 EGFR活化后，又激活下游的信号通路，引起基因转录，细胞增殖、分化、凋亡和极性，从而重构汗腺三维结构（图 2）。图 2 本假说可能的机制：EGFR 激活的通路：通过经典的受体-配体途径；我们前期去除汗腺细胞培养基中的 EGF，对汗腺 3D 的形成并无影响，表明外源性 EGF 并不是 EGFR 激活所必须的；但不排除汗腺细胞有自分泌 EGF 的能力，通过自分泌方式激活 EGFR。非经典的受体 -配体途径（integrin 依赖途径）激活，细胞粘附到细胞外基质（ECM）主要由 integrin 介导，是连接细胞外基质和细胞的主要的细胞，我们前期研究在汗腺培养基中加入 integrin 功能阻断剂，汗腺同样不能形成 3D 结构，表明 Integrin 有可能通过某种方式激活EGFR。激活的 EGFR，激活下游信号通路，引起基因转录，细胞增殖、分化、存活、凋亡，形成汗腺 3D 结构。参考文献1. 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Cell Tissue Res. 2013; 354(3):897-902.） 。取大小为 2.0 cm 0.3 cm 全层皮肤，置于含 100 U/mL 青霉素、100 ug/mL 链霉素的平衡盐溶液中反复漂洗后，去除皮下脂肪。在 60 mm 培养皿中，用眼科剪将皮肤剪成肉泥状，6加入 3 mL 含 2 mg/mL型胶原酶、5%FBS、100 U/mL 青霉素、100 ug/mL链霉素的 DMEM/F12，置 37、5%CO 2 及饱和湿度培养箱中，孵育 56 h 后用 100 uL 微量移液器吸取游离汗腺，吸取的游离汗腺置于含5%FBS、100 U/mL 青霉素、100 ug/mL 链霉素的 DMEM/F12 的 60 mm 培养皿中，再从此培养皿中吸取汗腺至型胶原预先包被的 60mm 培养皿中，加入 1 mL 汗腺细胞培养基（含 20 ng/mL 重组人 EGF、25 mg/mL 牛垂体提取物、100 U/mL 青霉素和 100 ug/mL 链霉素的 KSFM） ，置 37、5%CO2 及饱和湿度培养箱中培养；24 h 后补加 2 mL 汗腺细胞培养基继续培养。以后每 23 天换液 1 次。倒置相差显微镜下观察细胞生长和形态变化，并拍照。1.2 人外泌汗腺细胞的传代 2D 爬片培养：待原代汗腺细胞达 70-80%融合后，吸弃原培养液，用无钙镁离子的平衡盐溶液洗 2 次，加入 2 mL 含 0.25%胰蛋白酶的消化液，置 37、5%CO 2 及饱和湿度培养箱中孵育 25 min，加入 4 mL 含 10%FBS 的 DMEM/F12 终止消化；1000r/min 离心 5 min，收集细胞，计数。把收集的汗腺细胞用汗腺细胞培养基重悬，调整细胞浓度至1106/mL。把无菌的、型胶原预先包被好的直径为 12mm 的 Fisher 细胞生长盖玻片置于 24 孔板内，每孔加 0.1ml 细胞悬液至盖玻片，待汗腺细胞贴壁后（接种后 12-24h） ，补加 0.4ml 汗腺细胞培养基，每 2-3d 换液一次，待盖玻片上生长的细胞达 70%融合后，终止培养。生长在盖玻片上的汗腺细胞用-20的甲醇：丙酮（1:1）固定 30min，细胞爬片置-20备用。2. 人外泌汗腺体外 3D 培养模型的建立（已经完成） 。待原代 2D 培养汗腺细胞达 70-80%融合后，收集细胞并计数细胞， 把收集的汗腺细胞用汗腺细胞培养基重悬，调整细胞浓度至 5105/mL。取0.3 mL 细胞悬液与 0.3 mL 4液态 Matrigel 于冰上快速混匀，避免产生气泡。将混匀液加入至预冷的 12 孔板，室温放置 30 min，待混合液凝固后加入汗腺细胞培养基，置 37、5%CO 2 及饱和湿度培养箱中培养。之后隔天换液 1 次，倒置相差显微镜下观察细胞生长和形态变化，并拍照。3D 培养14d 后，终止培养。吸弃培养基，用 0.1M PBS 洗 3 遍，取 3 条约112mm 大小的新生物组织块，固定于 2.5%戊二醛，4避光保存，送电镜室做透射电镜检测；剩余部分置于 10%多聚甲醛固定 12-24h，常规脱水、7石蜡包埋、切片。实验二、EGFR 在汗腺三维重构中的作用1. 分组：分为 2 组。正常对照组：用汗腺细胞培养基培养。EGFR 抑制剂组：汗腺细胞培养基中加入最低抑制浓度的 AG1478。2. 各组汗腺处理方法。2.1 正常对照组：正常汗腺细胞和常规汗腺细胞培养基。又分为 d1d14 亚组，分别在培养第 114 天取材。 目的是了解汗腺 3D 结构形成过程（如同体内汗腺发育一样）。2.2 EGFR 抑制剂组： 测定 AG1478 抑制汗腺 3D 结构形成的最低抑制浓度。我们预实验发现AG14780.5（AG1478 储备液浓度为 1mM） ，抑制汗腺 3D 重构；DMSO0.1%，对汗腺生长无明显影响，本实验我们采用 0.5 的AG1478。 又分为 d1d10 亚组，分别从培养第 110d 加入 AG1478（10d 时，汗腺形成稳定 3D 结构），培养至 14d。均在实验结束取材。3. 人外泌汗腺体外的 3D 培养。以上各组均细胞分别与生长因子减少型 matrigel混匀后，就行 3D 培养，共培养 14d。显微镜下观察 3D 形成的时间、3D的数量、大小。4. 检测指标。 细胞增殖。检测： BrdU、 PCNA、 Ki67目的：EGFR 对细胞增殖的影响。 凋亡。检测：凋亡试剂盒 或组化检测 Caspase-3 表达目的：EGFR 对细胞凋亡的影响。 腔形成。检测：HE 染色即可观察。目的：EGFR 对腔形成的影响。8 细胞极性。检测：ZO-1， 4-integrin 的表达。目的：EGFR 对细胞极性的影响。 细胞存活和细胞周期检测：FACS 和台盼蓝染色。目的：EGFR 对细胞存活和细胞周期影响。 基底膜形成检测：六胺银基底膜染色目的：EGFR 是否影响基底膜形成。 细胞分化。检测：镜下和 HE 染色观察类管状结构和类腺体状结构的形成。目的：EGFR 对细胞分化的影响。 EGFR 和 P-EGFR 基因（RT-PCR）和蛋白(Western)表达。5. 根据以上结果，研究 EGFR