核苷酸代谢讲义

第十章 核酸代谢要求掌握：遗传信息传递的中心法则，原核细胞 DNA 复制及 RNA 转录的酶、有关概念和基本过程。熟悉：DNA 半保留复制的实验证据；逆转录酶活性和逆转录的应用。了解：核苷酸分解代谢的终产物、生物合成的方式。原核生物与真核生物复制、转录的区别。重点内容：遗传信息传递的中心法则，原核细胞 DNA 半保留复制，RNA 转录。难点内容：DNA 复制的过程，原核生物 RNA 转录的相关概念。第一节 核苷酸的代谢一、嘌呤核苷酸的合成代谢体内嘌呤核苷酸的合成有两条途径。第一，由简单的化合物合成嘌呤环的途径，称从头合成（de novo synthesis）途径。第二，利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷，经过简单的反应过程，合成嘌呤核苷酸，称为补救合成（或重新利用） （salvage pathway）途径。肝细胞及多数细胞以从头合成为主，而脑组织和骨髓则以补救合成为主。（一）嘌呤核苷酸的从头合成(1) 原料核素示踪实验证明嘌呤环是由一些简单化合物合成的，如图 10-1 所示，甘氨酸提供 C-4、C-5 及 N-7；谷氨酰胺提供 N-3、N-9; N 10-甲酰四氢叶酸提供 C-2, N5，N 10-甲炔四氢叶酸提供 C-8;CO2 提供 C-6。磷酸戊糖则来自糖的磷酸戊糖旁路，当活化为 5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP ）后, 可以接受碱基成为核苷酸。其活化的反应式如下。（2）过程合成的主要特点是在磷酸核糖的基础上把一些简单的原料逐步接上去而成嘌呤环。而且首先合成的是次黄嘌呤核苷酸(IMP)，由后者再转变为腺嘌呤核苷酸(AMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)1. IMP 的合成2.AMP 和 GMP 的合成需要说明的是，AMP 和 GMP 是不能直接转换的，但 AMP 可在腺2苷酸脱氨酶催化下脱去氨基，生成 IMP，然后再利用 IMP 合成 GMP。作为核酸合成的底物是核苷三磷酸的形式，通过激酶的作用及 ATP 供能，AMP 和 GMP 可转变成 ATP 及 GTP。（二）嘌呤核苷酸的补救合成虽然从头合成途径是嘌呤核苷酸的主要合成途径，但嘌呤核苷酸从头合成酶系在哺乳动物的某些组织(脑、骨髓)中不存在，细胞只能直接利用细胞内或饮食中核酸分解代谢产生的嘌呤碱或嘌呤核苷重新合成嘌呤核苷酸，称为补救合成。补救合成的过程比从头合成简单得多，消耗ATP 少，且可节省一些氨基酸的消耗。有两种酶参与补救合成，腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyl transferase,APRT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)。补救合成同样由 PRPP 提供磷酸核糖。腺嘌呤核苷通过腺苷激酶（adenosine kinase）的作用可变成 AMP 而重新利用。类似地，其他核苷也可由相应的激酶磷酸化得到相应的核苷酸由于基因缺陷导致 HGPRT 活性严重不足或完全缺乏，是一种 X 染色体连锁的隐性遗传病，称为 Lesch-Nyhan 综合征或称自毁容貌征，患儿在二三岁时即开始出现症状，如尿酸过量生成，智力迟钝，甚至自身毁容，这种患儿很少活到成年。现在科学家正研究将由功能的 HGPRT基因，借助基因工程的方法转移至患者的细胞中，以达到基因治疗的目的。（三）嘌呤核苷酸合成的调节嘌呤核苷酸的合成受反馈抑制（feedback inhibition）调节。抑制物及作用部位1.PRPP 合成酶：PRPP 浓度是从头合成过程的最主要决定因素。PRPP合成的速度又依赖磷酸戊糖的存在和 PRPP 合成酶的活性。PRPP 合成酶受嘌呤核苷酸的别构调节。其中，IMP、AMP 和 GMP 可对 PRPP 合成酶反馈抑制以调节 PRPP 的水平。2. 谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶：IMP 对催化嘌呤核苷酸合成的定向步骤的酶即谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶有反馈抑制，而 AMP 和 GMP对 IMP 的反馈抑制有协同作用；PRPP 增加可促进谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶活性，加速 PRA 生成。33.过量 AMP 会抑制 IMP 转变成 AMP，而过量 GMP 会抑制 IMP 转变成GMP，从而使这两种核苷酸合成速度保持平衡。另外，GTP 是 AMP 合成时必需的能源，而 ATP 是 GMP 合成时必需的能源，这种作用使腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸的合成的以保持平衡。3嘌呤核苷酸合成的抗代谢物6-巯基嘌呤 (6-mercaptopurine,6MP)，其化学结构与次黄嘌呤相似，只是后者 C-6 的羟基被巯基取代。它在体内可变成 6-MP 核苷酸，可以反馈抑制 PRPP 合成酶和谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶的活性，也能抑制 IMP 转变成 AMP 和 GMP，从而可抑制肿瘤生长。二、 嘧啶核苷酸的合成代谢与嘌呤核苷酸一样，体内嘧啶核苷酸的合成亦有两条途径，即从头合成及补救合成。（一）嘧啶核苷酸的从头合成1、原料核素示踪实验证明，合成嘧啶碱的原料如图 10-5。2、过程与嘌呤核苷酸的从头合成不同，嘧啶核苷酸是先合成嘧啶环，然后再与磷酸核糖相连，形成嘧啶核苷酸。全过程见教材，此过程主要在肝细胞的胞液中进行。除了二氢乳清酸脱氢酶位于线粒体内膜上外，其余均位于胞液中。（二）嘧啶核苷酸的补救合成由嘧啶磷酸核糖转移酶(pyrimidine phosphoribosyl transferase)催化尿嘧啶、胸腺嘧啶等，与 PRPP 合成一磷酸尿嘧啶核苷酸（但不能利用胞嘧啶为底物）。另外，嘧啶核苷激酶可使相应嘧啶核苷磷酸化成核苷酸。（三）嘧啶核苷酸合成的调节原核生物和真核生物中，从头合成途径所需的酶不同，因而途径所受的调控也不一样。第一个调节部位在原核生物中，是天冬氨酸氨基甲酰转移酶（asparate carbamoyl transferase, ACTase） ，CTP 是其别构抑制剂，ATP 是别构激活剂。氨甲酰基磷酸合成酶在真核生物及原核生物都是反馈抑制的调控点，受 UTP 的抑制，但可被 PRPP 激活。第二个调节部位是乳清酸脱羧酶处，受 UMP 抑制。4由于 PRPP 合成酶是嘧啶与嘌呤两类核苷酸合成过程中共同需要的酶，它可同时接受嘧啶核苷酸及嘌呤核苷酸的反馈抑制。三、脱氧核糖核苷的生成脱氧核苷酸是由二磷酸核苷还原而成。现知脱氧核苷酸中的脱氧核糖并非先形成后再合成为脱氧核苷酸，而是在二磷酸核苷(NDP，N 代表A、G、U、C、T 等碱基)水平上直接还原，即以氢取代其核糖分子中 C-2 的羟基而成的，催化此反应的酶是核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,RR)RR 是一种别构酶，由 B1 和 B2 两个亚基组成，在 B1 亚基上有两个结合部位，一为底物特异性部位，另一为总活性调节部位。此外，B1 还含有巯基（SH） ，供直接还原核糖之用。现知 RR 从 NADPH 获得电子时，还需要一种硫氧化还原蛋白(thioredoxin,T)作为电子载体及硫氧化还原酶（thioredoxin reductase,TR）及其辅基 FAD 参加。整个过程如图 10-8 所示。RR 的活性受一些别构调节剂的调节。dATP 是所有四种底物还原酶的抑制剂，当 dATP 结合至总活性部位时，该酶活性降低，反映脱氧核苷酸过剩，ATP 能消除此反馈抑制。当 dATP 或 ATP 结合至底物特异性部位时，促进嘧啶核苷酸 UDP 及 CDP 的还原。dTTP 则促进 GDP 的还原，及抑制 UDP和 CDP 的进一步还原。dGTP 促进 ADP 的还原。由此可见 RR 有多种构象状态，各具有不同的催化活性，从而为 DNA 合成提供数量平衡的四种脱氧核苷酸为底物。若产物不平衡会影响 DNA 的合成，严重者可导致疾病（见下） 。四、脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成首先，dUDP 转换为 dUMP，有几条途径，一条是在核苷单磷酸激酶催化下，dUDP 与 ADP 反应生成 dUMP 和 ATP；另一条途径是 dUDP 先形成dUTP，然后水解生成 dUMP 和 PPi。dCMP 经脱氨也可以形成 dUMP。然后，dTMP 是由 dUMP 的 C-5 甲基化而形成的。催化此反应的酶是胸腺嘧啶核苷酸合酶(thymidylate synthase) 。甲基由 N5,N10_甲炔 FH4 提供。反应中形成的 FH2 须经二氢叶酸还原酶的作用变成 FH4，才能重新载带甲基。 DNA 合成的底物为四种 dNTP，一磷酸或二磷酸脱氧核苷可由激酶的催化和 ATP 供能而形成三磷酸脱氧核苷。五、 核苷酸的分解代谢5（一）嘌呤核苷酸的分解代谢AMP 在腺苷酸脱氨酶作用下生成 IMP，再在核苷酸酶作用下水解成次黄苷和磷酸，或者 AMP 在核苷酸酶作用下水解成腺苷，再经腺苷脱氨酶作用生成次黄苷。次黄苷经嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase, PNP）生成次黄嘌呤和磷酸核糖。磷酸核糖可转变成磷酸核糖，进入磷酸戊糖途径或再合成 PRPP。次黄嘌呤既可进入补救途径，也可进一步分解，即次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化下氧化成黄嘌呤，在同一酶的催化下进一步氧化成终产物尿酸。而 GMP 分解生成的鸟嘌呤氧化成黄嘌呤，再变成尿酸。腺苷脱氨酶（adenosine deaminase,ADA）基因缺陷是一种常染色体隐性遗传病，由于基因突变造成酶活性下降或消失，常导致AMP， dAMP 和 dATP 蓄积，dATP 是核糖核苷酸还原酶的别构抑制剂，能减少 dGDP, dCDP 和 dTTP 合成，从而 DNA 合成受阻。由于正常情况下淋巴细胞中腺苷酸脱氨酶活性较高，当 ADA 基因缺陷时，可造成严重损害，导致细胞免疫和体液免疫反应均下降，甚至死亡，即严重联合免疫缺陷症（severe combined immunodeficiency, SCID） 。ADA 基因突变引起的 SCID 是第一个进行基因治疗的病种，即在体外将正常的 ADA 基因转导患者的淋巴细胞，再回输体内。PNP 基因缺陷是一种罕见的常染色体隐性遗传病，纯合子 PNP 基因缺陷的患儿表现为 T 细胞免疫缺陷。原因是 PNP 不能发挥正常作用，所以患儿体内鸟苷、脱氧鸟苷、次黄苷及脱氧次黄苷浓度均增加，脱氧鸟苷转化成 dGTP，造成 dGTP 堆积，是核糖核苷酸还原酶的别构抑制剂，导致 dCDP 及 dCTP 下降，最终 DNA 合成不足，影响胸腺细胞增殖，导致 T 细胞免疫缺陷。可见嘌呤核苷酸的分解代谢的终产物为尿酸，后者经肾脏排泄。痛风症（gout）患者由于血中尿酸含量升高，尿酸水溶性较差，形成的晶体沉积于关节、软组织、软骨及肾等处，导致关节炎、尿路结石及肾疾病等，痛风症多见于成年男性。原发性痛风症由于 HGPRT 活性降低，嘌呤碱不能通过补救合成途径合成核苷酸再利用，即分解成尿酸。此外，大量PRPP 促使嘌呤的从头合成加快。继发性痛风症由于肾功能减退，尿酸排出减少。治疗原则：用促进尿酸排泄的药物，或用抑制尿酸形成的药物。例如别嘌呤醇（allopurinol）在体内氧化成别黄嘌呤，后者能与黄嘌呤氧6化酶结合成不可逆的复合物，所以别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶的强烈抑制剂。（二）啶核苷酸的分解代谢嘧啶核苷酸的分解可先脱去磷酸及核糖，余下的嘧啶碱进一步开环分解，最终产物为 NH3、CO 2、丙氨酸及 氨基异丁酸，这些产物均易溶于水，可随尿排出体外。第二节 DNA的生物合成的几个原则遗传信息传递的中心法则：一、半保留复制Watson 和 Crick 于 1953 年提出的 DNA 双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为 DNA 分子的复制提供了理论基础，即亲代的 DNA 双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导 DNA 新链的合成，这样合成的两个子代 DNA 分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA 链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制 (semiconservative replication)。用 15N 标记亲代的 DNA 链，而用 14N 标记新合成的 DNA 链的实验，证实子代的 DNA 分子，一股链含 15N，另一股含 14N。二、半不连续复制DNA 双螺旋的两股链是反向平行(antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为 53，另一股为 35。那么体内是否存在两种 DNA聚合酶?一种催化核苷酸以 53方向聚合，另一种以 35方向聚合。但从现知所有的 DNA 聚合酶都只能催化 53 方向合成。这个问题直到1968 年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌 DNA 复 制过程中出现一些含 1000 72000 个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为冈崎片段(Okazaki fragment)。因此，复制时亲代 DNA 分子中那股 35方向的母链作为模板，指导新链以 53方向连续合成，此链称为前导链(1eading strand)。在前导链延长 1000 2000 个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿 53合成 1 000 2 000 个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称为随从链(1agging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以 DNA 为半不连续复制(semi-discontinuous replication)，如图 12-2 所示。复制后，这些冈崎片段由 DNA 连接酶的作用而连接成完整的新链。三、RNA 引物目前所发现的 DNA 聚合酶都需要一个具 3-OH 的引物，才能将合成原料 dNTP 一个一个接上去。因为 DNA 聚合酶不能催化两个游离的 dNTP在 DNA 模板上进行聚合，如图 12-3 所示。实验又发现抑制 RNA 聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin) 能抑制 DNA 的复制。再者在体外 DNA 复制实验中发现冈崎片段的 5端都有一小段 412 个核苷酸的 RNA 引物(RNA primer)。现知 RNA 聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离 NTP 聚合。可见 RNA 引物为 DNA 聚合酶提供聚合新核苷酸所需的 3-OH 。RNA引物最后被 DNA 聚合酶除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由 DNA连接酶封口。在 DNA 的复制需要 RNA 引物呢，除了 DNA 聚合酶不能催化两个游离dNTP 的聚合，而 RNA 引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少DNA 复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用 RNA 引物，即使出现差错，由于最后将被 DNA 聚合酶切除，便可提高 DNA 复制的真实性。四、复制的真实性DNA 复制过程是非常复杂的，需要许多酶类和蛋白质因子参加。这既8保证 DNA 复制的速度，又保证产物的高度真实性。这也保证了自然界种族延续中生物遗传特性的相对稳定性。第三节 参与 DNA 复制的一些酶类和蛋白质一、 大肠杆菌的 DNA 聚合酶DNA 聚合酶（DNA polymerase）的作用是将脱氧核苷酸连接成 DNA，所用底物必须是四种脱氧核苷三磷酸(dNTP ) ，Mg 2+存在和一个 DNA 模板，按模板的序列将配对的脱氧核苷酸逐个接上去，并且需要一个具有 3-OH的 RNA 引物或 DNA 的 3-OH 端。使 3-OH 与合成上去的 dNTP 分子-磷酸连接成 3，5磷酸二酯键，合成方向为 53，如图 12-4。从大肠杆菌纯化得到 3 种 DNA 聚合酶(， )。(一) DNA 聚合酶 1955 年 Kornberg 发现了 DNA 聚合酶(简称为 pol)，故也称为Kornberg 酶，并因此而获得诺贝尔奖金。 DNA 聚合酶是一条分子质量为103X103 Da 的多肽链。具有多种催化功能。若用蛋白酶轻度水解可得一个分子质量 68X103 Da 的大片段和一个分子质量为 36X103 Da 的小片段，常将大片段称为 Klenow 片段，此片段具有两种催化活性，一为上述的聚合功能，另一为 35外切酶的活性，从 3端水解 DNA 产生 3单核苷酸，如图 12-5 所示。这种 35外切酶活性对保证 DNA 复制的真实性具有重要的意义。DNA 聚合酶在接上新的核苷酸前，它能对 3末端的碱基进行识别。若为配错的碱基，即通过 35外切酶活性把配错的碱基切除，再使正确的碱基聚合上去，保证 DNA 复制的高度真实性，这种功能也称校读功能(proof reading)。小片段则具 5 3外切酶的活性，它能从 53方向一个挨一个切除，产物为 5单核苷酸，或跨过若干个核苷酸再进行酶解，从 5末端释放一寡核苷酸。可除去冈崎片段 5端的 RNA 引物和在 DNA 损伤修9复中起重要的作用。可见，DNA 聚合酶为一条多肽链上具有三种酶的活性，也是一种多功能酶(图 12-7)。但 DNA 聚合酶并不是大肠杆菌 DNA 复制中主要的 DNA 合成酶，它的主要作用，是切除 RNA 引物、填补空缺和 DNA 损伤的修复。DNA 聚合酶为一条多肽链上具有三种酶的活性，是一种多功能酶( 图 12-7)。鉴于 Klenow 片段兼具聚合及 35外切活性，能非常准确按模板碱基序列合成 DNA，所以此片段是分子生物学常用的工具酶。(二) DNA 聚合酶 由一条多肽链构成。此酶除具有聚合酶的活性外，还具有 35外切酶活性。它在生物体内的确切作用不详，可能也是在 DNA 损伤修复中起作用。(三) DNA 聚合酶 此酶是一个多聚酶，由 10 种不同亚基组成的( 图 12- 8)，称为 DNA 聚合酶全酶(DNA po1ymerase ho1oenzyme)。它具有三个特点：是一种非常高的续进性(processivity) 酶。所谓续进性即在 DNA 聚合酶与模板分离下来之前加入的核苷酸平均数。续进性500 000。而 DNA 聚合酶仅合成3200 个核苷酸即自模板上释放。DNA 聚合酶 催化活性比 DNA 聚合酶高很多倍，每秒可催化 1 000 个核苷酸的聚合，而 DNA 聚合酶每秒仅催化 1620 个核苷酸聚合。DNA 聚合酶不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有 35外切酶活性，产物真实性高。所以，大肠杆菌 DNA聚合酶是 DNA 复制必需的酶。DNA 聚合酶聚合和校正功能分别存在于 和 亚基。DNA 聚合酶全酶分子质量约 900X103 Da，全酶成不对称的二聚体，围绕着 DNA 双螺旋，每个单体都具有催化活性，一个作用于前导链，另一个作用于随从链，使 DNA 两股链在同一位置同一时间进行合成。10二、真核细胞的 DNA 聚合酶真核细胞的 DNA 聚合酶有 5 种，即 DNA 聚合酶 、 和。DNA 聚合酶 负责随从链的合成，DNA 聚合酶 和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)负责前导链的合成。PCNA 是作为DNA 聚合酶 活性所需的一种辅助蛋白，有与 E.coli DNA 聚合酶的 亚基类似的结构和功能，形成环状的夹钳，大大地增强 DNA 聚合酶 的续进性。DNA 聚合酶 负责线粒体 DNA(mitochondria DNA, mt DNA)的复制，DNA 聚合酶 和 的功能为 DNA 的修复。三、解旋、解链酶类复制时 DNA 双螺旋要解开，才能在原来的母链上合成新链。复制在不断延伸，螺旋要不断解开。若每秒钟复制 1 000 个碱基对，则要解旋 100 次。这样必然在复制前方产生很大的张力，使 DNA 缠结，这要靠 DNA 拓扑异构酶等来解决。(一) DNA 解链酶DNA 复制时，复制开始部位的 DNA 双螺旋必须解开成单链，模板链上的碱基才能以碱基配对原则，指导新链的合成。解开 DNA 双螺旋的酶有多种，称为 DNA 解链酶(DNA helicase)，该酶具有 ATP 酶的活性，在 ATP 的存在下，该酶能解开 DNA 双链，每解开 1 对碱基消耗 2 个 ATP。(二) 单链 DNA 结合蛋白单链 DNA 结合蛋白(single strand binding protein，SSB)或螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein HDP)，能与已被解链酶解开的单链 DNA 结合，以维持模板处于单链状态，又可保护其不被核酸酶水解。单链 DNA 结合SSB 后既可避免重新形成双链的倾向，又可避免自身发夹螺旋的形成，还能使前端双螺旋的稳定性降低，易被解开。当 DNA 聚合酶在模板上前进，逐个接上脱氧核苷酸时，SSB 即不断脱离，又不断与新解开的链结合。(三) DNA 拓扑异构酶11拓扑一词是指物体作弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA 拓扑异构酶(topoiso-merase)有两类：其中拓扑异构酶，曾有过多种其他名称如转轴酶、解缠酶等。它能切断 DNA 双链中的一股，使 DNA 解链旋转时不致缠结，解除张力后又把切口封闭。拓扑异构酶，又称旋转酶(gyrase)，暂时切断 DNA 双链，使另一 DNA 双链经过此切口，随后又再封闭切口。四、引发体引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是 DNA 复制开始所必需的。引发体中的某些蛋白质如 DnaA 能结合至 DNA 复制起始部位，DnaB 具有解链酶的作用，DnaC 辅助 DnaB 结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的 DNA 单链按碱基互补配对催化 NTP 聚合，合成一小片段的 RNA，作为 DNA 合成的引物，即沿此引物 RNA 的 3-OH 进行延伸。五、DNA 连接酶DNA 连接酶(DNA 1igase)催化两段 DNA 链之间磷酸二酯键的形成。要求 DNA 链3端有游离的 OH，而 5端带有磷酸根，连接过程需要 ATP 供能,如图 12-9。DNA 连接酶不能连接两分子单链的 DNA，只能作用双链 DNA 分子中一股链上的缺口，或双链 DNA 分子双股的缺口。如 DNA 经限制性内切核酸酶切割后，两个片段的粘性末端相配，DNA 连接酶能使之连接。即使是两段平齐 DNA，DNA 连接酶也能使之连接。在 DNA 复制过程中，当 RNA引物清除后，靠 DNA 聚合酶填补空缺，冈崎片段之间的缺口靠 DNA 连接酶作用而连成完整的一条新链。DNA 连接酶在 DNA 损伤修复中亦起重要作用，并且是一种重要的工具酶。第四节 DNA 复制过程12一、复制的起始大肠杆菌复制时有特定的起始部位称为 oriC，长度为 245bp。有 3 个串连排列的核苷酸序列，每个由 13 个核苷酸组成。其序列基本相同为GATCTNTTNTTTT，而且 GATC 在 oriC 部位出现 11 次，oriC 还有 4 个DnaA 结合位点，是 4 个 9bp 序列的反向重复，这些序列都是高度保守的（图 12-10。 ）DnaA 先结合至复制起始点，然后发动了复杂的变化。DnaB 和 DnaC 亦参加进去，从而使双链解开，DNA 结合蛋白便与单链 DNA 结合。接着引物酶按碱基配对原则合成一小段的 RNA 引物，此引物的 3-OH 可供 DNA 聚合酶将第一个 dNTP 加到 3-OH 上而形成 3 ，5磷酸二酯键。复制是从 oriC 开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制 (bi-directional replication)。 复制开始后由于 DNA 双链解开，在两股单链上进行复制。在电子显微镜下观察 DNA复制前进部位伸展成叉状，称为复制叉(replication fork)，如图 12-12。二、 复制的延长在 DNA 聚合酶的作用下，新合成的 DNA 链不断延长。大肠杆菌的冈崎片段长度为 1 0002 000 个核苷酸，即前导链合成 1 0002 000 个核苷酸后，随从链便开始合成。在延长过程中，由于拓扑异构酶的作用，避免了在复制叉前方的 DNA 打结。三、复制的终止在 DNA 延长阶段结束后，原核生物的 RNA 引物被 DNA 聚合酶切除。留下的空隙，由 DNA 聚合酶进行补满，即从另一冈崎片段的 3-OH 按53根据碱基配对原则，将一个个的 dNTP 补上去。最后的缺口再由DNA 连接酶将相邻的两个核苷酸借磷酸二酯键连起来，即成完整的一条新链，DNA 的复制即告完成，如图 12-15。13四、真核生物端粒 DNA 的复制真核生物线性染色体的两个末端称为端粒(telomere)。按上述 DNA 复制机制新合成子链 5端的那段 RNA 引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞分裂或 DNA 复制都是如此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。端粒 DNA 的结构和端粒酶对端粒 DNA 序列的分析，发现端粒 DNA 的 3端是由数百个串联重复GT 丰富的短的寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。端粒 DNA 序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶(telomerase)，该酶由蛋白质和 RNA 两部分组成，其中 RNA 作为合成端粒 DNA 的模板，端粒酶是目前所知唯一携带 RNA 模板的逆转录酶，具有种属特异性，例如四膜虫的端粒酶，其 RNA 部分含 159 个核苷酸，其中有一段序列为 5-CAACCCCAA-3可作为合成端粒 DNA3端 GT 丰富序列-GGGGTT- 模板。人端粒酶的 RNA 含 450 个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。这样可防止细胞分裂时 DNA 复制端粒的缩短。 端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度，端粒酶活性又重新出现，对端粒进行补偿，使之永不衰亡，形成恶性增殖。五、原核细胞和真核细胞DNA复制的区别-见P501六、 逆转录合成DNA 某些病毒的基因组是 RNA，而不是 DNA，这类病毒称为 RNA 病毒。141964 年 Temin 观察到有些致肿瘤的 RNA 病毒（如鸡肉瘤病毒 avian sarcoma virus，ASV）感染细胞的作用能被 DNA 复制抑制剂（如甲氨喋呤，MTX ） 、5FdUMP 等所阻断，说明 ASV 的繁殖需要 DNA 的合成。另一发现为放线菌素 D 能抑制子代病毒颗粒的产生。放线菌素 D 是抑制以 DNA 为模板的RNA 合成，这说明 RNA 肿瘤病毒在宿主细胞的繁殖，需要通过细胞 RNA的合成。因此，Temin 大胆提出一种设想，即 RNA 肿瘤病毒先变成 DNA 原病毒(provirus)，再产生 RNA 肿瘤病毒。这意味着遗传信息也可以从 RNA 流向 DNA。1970 年 Temin 和 Baltimore 各自发现 RNA 肿瘤病毒含有一种酶，称为逆转录酶(reverse transcriptase)。这种酶以 RNA 为模板，在有 4 种 dNTP 存在及合适条件下，能按碱基互补配对的原则，合成互补 DNA(complementary DNA， cDNA)。这种酶也称 RNA 依赖的 DNA 聚合酶 (RNA-dependent DNA polymerase)。由于 RNA 肿瘤病毒含有这种逆转录酶，所以也称为逆转录病毒(retrovirus) 。这一发现使生物中心法则内容更充实和完善。Temin 和Baltimore 也因此而获得诺贝尔奖金。1、逆转录：以 RNA 为模板，dNTP 为原料，按碱基配对规律合成 DNA 的过程，由逆转录酶催化。2、逆转录酶（reverse transcriptase）又称为反转录酶，为依赖RNA的DNA 聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性：逆转录活性：即以 RNA 为模板合成 DNARNaseH 活性：水解 RNA:DNA 中的 RNADNA pol 活性：以 DNA 为模板合成 DNA3、生物学意义（1） 丰富和发展了中心法则（2） 丰富和发展了致癌理论（3） 在基因工程中的应用第五节 RNA 合成（转录）15转录 (transcription) 是以 DNA 单链为模板，NTP 为原料，在 DNA 依赖的 RNA 聚合酶催化下合成 RNA 链的过程。表 1 转录与复制的异同差 异 相 同转录 复制 或相似模板 基因的模板链转录 2 股链均全复制 DNA原料 NTP dNTP 核苷三磷酸碱基配对 A-U，T-A；G-C A-T；G-C 遵从碱基配对原则聚合酶 RNA 聚合酶 DNA 聚合酶 依赖 DNA 的聚合酶 产物 mRNA，tRNA，rRNA 等 DNA 多核苷酸链转录的模板是单链 DNA，与复制的模板有较多的不同特点，引出了下列相关概念。转录过程只以基因组 DNA 中编码 RNA（ mRNA、tRNA、rRNA 及小 RNA）的区段为模板。把 DNA 分子中能转录出 RNA 的区段，称为结构基因（structure gene） 。结构基因的双链中，仅有一股链作为模板转录成RNA，称为模板链(template strand)，也称作 Watson（W）链(Watson strand)、负（-）链 (minus strand)或反意义链(antisense strand)。与模板链相对应的互补链，其编码区的碱基序列与 mRNA 的密码序列相同（仅 T、U 互换） ，称为编码链(coding strand)，也称作 Crick（C ）链（Crick strand） 、正（+）链(plus strand)，或有意义链(sense strand)。不同基因的模板链与编码链，在 DNA 分子上并不是固定在某一股链，这种现象称为不对称转录(asymmetric transcription)。模板链在相同双链的不同单股时，由于转录方向都从 53，表观上转录方向相反。与 DNA 复制类似，转录过程在原核生物和真核生物中所需的酶和相关因子有所不同，转录过程及转录后的加工修饰亦有差异。一、参 与 转 录 的 酶16转录酶（transcriptase）是依赖 DNA 的 RNA 聚合酶（ DNA dependent RNA polymerase，DDRP） ，亦称为 DNA 指导的 RNA 聚合酶（DNA directed RNA polymerase） ，简称为 RNA 聚合酶（RNA pol） 。它以 DNA 为模板催化RNA 的合成。原核生物和真核生物的转录酶，均能在模板链的转录起始部位，催化 2个游离的 NTP 形成磷酸二酯键而引发转录的起始，如图 13-2 所示。因此，转录的起始不需引物，这也是转录与复制在起始阶段的一大区别。（一） 原核生物的 RNA 聚合酶细菌中只发现一种 RNA 聚合酶，能催化 mRNA， tRNA 和 rRNA 等的合成，研究得比较清楚的是大肠杆菌（E coli）的 RNA 聚合酶。1、 大肠杆菌 RNA 聚合酶的组成大肠杆菌 RNA 聚合酶的分子量约 450kDa，由四种 5 个亚基（ 2）组成全酶（holoenzyne） ， 亚基与全酶疏松结合，在胞内、外均容易从全酶中解离，解离后的部分（ 2）称为核心酶（core enzyme） 。通过利福霉素等抑制转录的实验研究，对转录酶各亚基的功能已有一定的认识： 亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启动子，从而决定哪些基因可转录； 亚基与底物（NTP）及新生 RNA 链结合； 亚基与模板 DNA结合； 和 亚基组成酶的活性中心，通过 DNA 的磷酸基团与核心酶的碱性基团间的非特异性吸附作用，核心酶能与模板 DNA 非特异性松驰结合； 亚基的功能是识别启动子，辩认转录起始点，但不能单独与 DNA 模板结合，当它与核心酶结合时，可引起酶构象的改变，从而改变核心酶与 DNA结合的性质，使全酶对转录起始点的亲和力比其他部位高 4 个数量级，在转录延长阶段， 亚基与核心酶分离，仅由核心酶参与延长过程。因此，亚基实际上被认为是一种转录辅助因子，因而称为 因子(factor)。2、 因子17生物体在生命周期的不同阶段或在内、外环境有所变化时，其基因表达有一定的时、空顺序，以适应生长、发育及环境变化的需要。RNA 聚合酶的活性是决定基因表达的重要一环。而 因子是 RNA 聚合酶识别及结合启动子的亚基，原核生物中所有 RNA 的转录都由同一种 RNA 聚合酶催化，在生命周期的不同阶段或不同环境下，这个酶如何识别所有转录单位的启动子，是由识别启动子的 因子来完成的。基因启动子 -35 和-10 区的共有序列（图 13-3）是 因子识别的位点，如表 13-2 所示，不同的 因子能识别的共有序列可以完全不同。（二） 真核生物的 RNA 聚合酶真核生物的 RNA 聚合酶已发现有三种，称为 RNA 聚合酶 I、II 和 III，分别负责转录不同的 RNA，它们对特异性抑制剂鹅膏蕈碱的敏感性亦有差异，如表 13-3 所示。二、 转录过程转录是生物合成 RNA 的过程，与复制相似，有起始、核苷酸链延长和链合成终止三个阶段。（一） 转录的起始转录的起始，就是形成转录起始复合物的过程。这一阶段反应所需的辅助因子，在原核生物与真核生物之间有较大的差异。1、 原核生物转录的起始转录的起始由 RNA 聚合酶与 DNA 模板的启动子(promoter)结合。经过对百种以上原核生物不同基因的启动子进行分析，发现启动子具有下列的共同点：在-10bp 处有一段共有序列（consensus sequence） ，富含AT，即 TATAAT-，系 Pribnow 等首先发现，因而称为 Pribnow 盒（box） ，再往上游-35bp 的中心处又有一组保守的共有序列，即-TTGACT-。启动子邻近的结构示如图 13-3。结合过程可分为二个步骤，首先由 因子辨认启动子的35 区，全酶18与该区结合，形成疏松的复合物，此时 DNA 双链未解开，因而称为封闭型转录起始复合物，继而 RNA 聚合酶移向10 区及转录起始点，在20 区处 DNA发生局部解链，形成 1217bp 的单链区，RNA 聚合酶与 DNA 结合更紧密，形成开放型转录起始复合物。以单链的模板链为模板，RNA 聚合酶上的起始位点和延伸位点被相应的 NTP 占据，聚合酶的 亚基催化第一个磷酸二酯键的生成， 亚基从全酶解离，形成 DNA-RNA 聚合酶（核心酶）结合在一起的起始延伸复合物。2、真核生物转录的起始真核生物有三种 RNA 聚合酶，分别催化不同 RNA 的合成，每种酶都需要一些蛋白质辅助因子，称为转录因子(transcription factor,TF)。为方便讨论，转录因子的命名冠以聚合酶的名称。如 RNA 聚合酶所需的转录因子称为转录因子（transcription factor, TF） 。（二） 转录的延长转录延长阶段发生的反应，在原核生物和真核生物比较相近。总的来说，一是聚合酶如何向转录起始点下游移动，继续指导核苷酸之间磷酸二酯键的形成，二是转录区的模板如何形成局部单链区，便于转录。原核生物 RNA 聚合酶催化转录起始，即核苷酸链中的第一个磷酸二酯键形成后， 因子从全酶中解离出来，核心酶就能沿 DNA 分子移动，真核生物RNA 聚合酶不仅需要较多的转录因子来催化起始，而且转录起始后，酶的移动也靠多种转录因子的共同作用使酶的构象发生改变来实现，如在 TFH 等作用下，聚合酶C 端丝氨酸残基的磷酸化是聚合酶向下游移动的重要因素。在转录延长过程中，DNA 双链需解开 1020 bp，形成的局部单链区象一个小泡，故形象地称为转录泡（transcription bubble） 。转录泡是指 RNA聚合酶-DNA 模板-转录产物 RNA 结合在一起形成的转录复合物。为了保持局19部的转录泡状态，在 RNA 聚合酶下游的 DNA 需不断解链，可使其下游的DNA（未解开双链部分）越缠越紧，形成正超螺旋，而其上游 DNA 变得松驰，产生负超螺旋，需要解旋酶（gyrase） 和拓扑异构酶来消除这些现象，如图 13-7。转录起始复合物中，核苷酸之间第一个磷酸二酯键的形成是由第一个核苷酸的 3-OH 与第二个核苷酸的 5-磷酸之间脱水而成。第一个核苷酸常为 G，来自 GTP 的 5-三磷酸仍保留，第二个核苷酸的 3-OH 仍然游离形成 5pppGpN-OH3。在聚合酶沿模板链的 35移动时，可按模板链碱基序列的指引，相应 NTP 上的 -磷酸可与延长新链的 3-OH 相继形成磷酸二酯键，其 、 磷酸基脱落生成焦磷酸后迅速水解，释放的能量进一步推动转录，使新合成的 RNA 链沿着 5 3方向逐步延长。在转录局部形成的 RNADNA 杂化双链之间的引力比 DNA 双链的弱（因为杂化双链间存在dArU 配对， dArU 的稳定性比 dAdT 的小） ，延长中的 RNA 链的 5-端会被重新形成的 DNA 双链挤出，使合成中的 RNA 的 5-端游离于转录复合物。（三） 转录的终止1、 原核生物转录的终止原核生物转录的终止有两种主要机制。一种机制是需要蛋白质因子（Rho）的参与，称为依赖 因子(factor)的转录终止机制，另一种机制是在离体系统中观察到，纯化的 RNA 聚合酶不需要其他蛋白质因子参与，可使转录终止，称为不依赖 因子的转录终止机制。（1）依赖 因子的转录终止： 因子是一种分子量为 46kDa 的蛋白质，以六聚体为活性形式。依赖 因子的终止位点，未发现有特殊的 DNA序列，但 因子能与转录中的 RNA 结合。 因子的六聚体被约 7080 nt的 RNA 包绕，激活 因子的 ATP 酶（ATPase）活性，并向 RNA 的 3端滑动，滑至 RNA 聚合酶附近时，RNA 聚合酶暂停聚合活性，使 RNADNA 杂化链解链，20转录的 RNA 释放出来而终止转录。如图 13-8 所示。（2） 不依赖 因子的转录终止： 在这种转录终止系统中，模板 DNA在终止位点附近有特殊的连续 T 序列，在连续 T 之前有富含 GC 互补区及几个插入碱基，如图 13-9。这种互补区的转录物可形成茎-环结构，影响 RNA聚合酶的构象使转录暂停；同时，由于转录产物的（rU）n 与模板的（dA）n 之间的 dArU 杂交区的双链是最不稳定的双链，使杂化链的稳定性下降，而转录泡模板区的两股 DNA 容易恢复双链，释出转录产物 RNA，使转录终止。2、 真核生物转录的终止真核生物转录终止的机制，目前了解尚不多，而且 3 种 RNA 聚合酶的转录终止不完全相同。RNA 聚合酶催化的转录有 18 bp 的终止子序列，可被辅助因子识别。RNA 聚合酶 II 和 III 催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖 因子的终止子相似的结构和终止机制，即有富含 GC 的茎-环结构(stem-loop structure)和连续的 U。由于成熟的 mRNA 3端已被切除了一段并加入了 poly A 尾,具体的转录终止点目前尚未认识。三、 转录的抑制作用（一）作用于模板 DNA 的转录抑制剂如放线菌素 D（actinomycin D） ，能插入至 DNA 双链中两对 dGdC 之间，低浓度时，阻止 RNA 链的延长，高浓