毛细管电泳—安培检测联用技术的方法和应用研究

毛细管电泳安培检测联用技术的方法和应用研究【摘要】：毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HPLC) 是二十世纪八十年代以来发展最为迅速的液相分离分析技术。由于二者在对复杂体系极强的分离分析能力,在药物分析、生化分析、食品分析、环境分析等几乎所有的分析化学领域得到广泛应用。与 HPLC 相比,CE 具有高达百万(理论板/m)的分离柱效、纳升级的进样量和快速的分离特点,在分离效率和分析成本上具有明显优势。然而,由于其极小的进样量,当与常规的紫外检测联用时,导致浓度检测灵敏度较低,不能满足有些痕量分析的要求；用激光诱导荧光检测必须进行衍生化,而衍生试剂种类有限,且存在衍生反应不充分和试剂干扰等问题；质谱检测由于存在较大的背景噪音还停留在实验室阶段。电化学检测中的安培检测技术,能对于自然界广泛存在的糖类、氨基酸、肽等物质产生直接的电化学响应；基于柱端检测的毛细管电泳-安培检测具有相对高的灵敏度,且线性范围宽、仪器简单、分析费用低的特点。目前,开发有更高灵敏度的修饰电极、可进行多指标同时测定的复合电极、对毛细管电泳-电化学检测(CZE-AD)的新缓冲体系的研究、接口研究等均是本学科的研究热点。高效液相色谱是目前成熟和稳定的分离分析技术,其中反相色谱-紫外检测由于其对生理活性分析物的普适性在生化分析中广泛应用。但是,紫外检测选择性差且生化样品组成复杂,如何选择适当的前处理技术使 HPLC-UV 检测干扰最小是令人关注的研究内容。本论文包括六章：第一章为绪论,简要地综述了毛细管电泳的发展历史、基本原理、分离模式、联用检测技术,应用领域研究进展以及本论文研究的目的意义。第二章采用氧化亚铜(Cu2O)、羧基化碳纳米管(MWCNT-COOH)和液体石蜡制备了一种新型的复合电极。该电极通过与羧基化石墨粉组成的复合电极进行对比试验,说明 MWCNT-COOH 对多酚存在电催化效应；对复合电极填充物进行形貌表征和电化学性质的研究；对 Cu2O 与 MWCNT-COOH 组成比例进行了优化。实验表明,Cu2O 与 MWCNT-COOH 组成为 3：1(w/w)时,复合电极同时对多酚、糖类表现出电流放大效应。该复合电极被应用于毛细管电泳-电化学检测中对糖和多酚进行测定。在优化分离条件下,绿原酸,芸香苷,蔗糖,葡萄糖,甘露糖和果糖能在100mmolL-1NaOH 中于 30 分钟内完成基线分离。多酚在 110-7-110-4molL-1、糖在 510-6-110-3molL-1 范围内呈现良好的线性,多酚和糖的检测限分别达 10-8molL-1、10-6molL-1 数量级(S/N=3)。该电极具有良好的抗钝化能力、对分析物的结果重现性较好。用该方法对市售的两个烟草产品中的多酚和糖进行了测定,结果满意。第三章研究了一种在 CZE-AD 中运用不同的缓冲溶液于分离、检测部分以实现对乌龙茶中糖、氨基酸和表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCg)进行同时测定的方法。该方法为以柱端射壁检测方式作为CZE-AD 接口 ,检测池中用 100mmolL-1NaOH 溶液使一根直径300m 的铜圆盘 (工作电极)表面对分析物形成电催化氧化；分离毛细管中,由 30mmolL-1 硼酸盐和 40mmolL-1 磷酸盐组成混合运行缓冲液,通过配位作用使分析物荷电后向检测端移动。在优化的电泳条件下,所有分析物能在 35min 内完成分离；方法有较低的检测限和相对标准偏差,在三个数量级范围内峰面积和分析物浓度间存在着良好的线性关系。最后,对乌龙茶汤实际样品进行了分析,结果满意。第四章针对用不同方法所做的芦笋多糖组成分析结果不同的问题,采用毛细管电泳-安培检测对芦笋多糖中的单糖组成进行测定。对“ 柱端射壁”检测模式中 ,铜电极直径变化对与毛细管接口的影响进行了详细对比研究。对实验中缓冲浓度,分离电压、进样时间对分离的影响进行研究。在优化条件下,7 个单糖在 120mmolL-1NaOH 被基线分离。灵敏度低、重现性良好。实验发现,芦笋多糖由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖组成,其摩尔比为17.8：5.5：1.0：14.2：17.2。相对于其他分析方法,采用毛细管电泳-安培检测方法进行芦笋多糖的组成分析具有快速、精确和进样量较低的优点。最后,对实验结果的差异进行了讨论。第五章利用 CZE-AD 对脑血栓片的四种活性成分阿魏酸、原儿茶醛、咖啡酸和原儿茶酸进行了测定。分别研究了工作电极电位、运行缓冲液的 pH 值和浓度、分离电压和进样时间等参数对实验结果的影响。最佳实验条件为：20mmolL-1 硼酸盐运行缓冲溶液 (pH=7.6)；工作电极为直径 300m 的碳圆盘电极,检测电位为+0.95V(vs.SCE)；分离电压和进样时间分别为 18kV、8S。上述条件下,分析物的线性范围超过 3 个数量级,检测限(S/N=3)为 6.010-9g/mL-3.010-8g/mL。将该方法应用于实际样品的分析,获得了良好的结果。第六章运用高效液相色谱-紫外检测法同时对大鼠 -胰岛细胞中的磷酸腺苷、NAD(H)进行分离测定；对常用的细胞中磷酸腺苷和辅酶的提取分离方法进行了研究,通过比较不同提取方法的回收率发现,高氯酸提取(PCA)路线是较好的提取工艺。提取物随后被一根 VenusilAQC-18 反向柱(250mm4.6mm,5m)分离,采用等度洗脱,流动相为 90%磷酸二氢钠(50mmolL-1,pH6.5)与 10%甲醇混合溶液。检测波长为 265nm,检测限为 ATP-2Na,ADP-2Na,AMP-2Na 为0.0684,0.1208,0.1024g/mL(S/N=3),NAD、NADH 分别为0.095、0.044g/mL(S/N=3),所有分析物在 0.04-1g/mL 范围内保持良好线性。所有分析物的平均回收率高于 80%。 【关键词】：毛细管电泳安培检测同时测定复合电极多壁碳纳米管缓冲溶液芦笋多糖脑血栓片 HPLC-UV 前处理【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2010【分类号】：O657.8【目录】：论文摘要 6-9ABSTRACT9-14 第一章绪论 14-47 第一节毛细管电泳概述 14-19 第二节毛细管电泳分离模式 19-24 第三节毛细管电泳的检测技术 24-27 第四节毛细管电泳- 安培检测技术联用的发展 27-31 第五节毛细管电泳-安培检测技术的应用现状 31-37 第六节 CE-AD 联用技术的发展趋势及本论文的意义 37-40 参考文献40-47 第二章基于 Cu_2O/MWCNT-COOH 复合电极的毛细管电泳 -安培检测法同时测定烟草中的糖和多酚 47-66 摘要 471 引言 47-492 实验部分 49-523 结果与讨论 52-634 结论 63 参考文献 63-66 第三章运用不同的检测和分离缓冲于毛细管电泳-安培检测测定乌龙茶汤中生理活性成分 66-80 摘要 661 引言 66-682 实验部分 68-693 结果与讨论69-774 结论 77-78 参考文献 78-80 第四章毛细管区带电泳- 安培检测分析芦笋多糖中的单糖组成 80-91 摘要 801 引言 80-822 实验部分82-833 结果与讨论 83-894 结论 89-90 参考文献 90-91 第五章毛细管电泳-安培检测法测定脑血栓片中的四种有效成分 91-101 摘要 911引言 91-922 实验部分 92-933 结果和讨论 93-984 结论 98-99 参考文献 99-101