洛阳欧立方医疗器械有限公司——医用臭氧应用

不同 浓 度医用臭氧对大鼠骨骼肌、滑膜及软骨的影响余斌 林庆荣 朱权 南方医科大学南方医院创伤骨，广东省广州市 510515摘要 目的 观察关节内注射不同浓度医用臭氧对大鼠骨骼肌、滑膜及软骨的影响。方法 30 只 Wistar 大鼠随机均分为 5 组， 对照组注射医用 纯氧，其它 4 组均在大鼠臀大肌、关节腔内穿刺并分 别注射 10g/ml、30g/ml、50g/ml、80g/ml的医用臭氧，每次 1ml，1 次/周，共 3 次。在不同时间 点取活 检行光镜下病理检查，观察 5 组大鼠骨骼肌注射臭氧 10min、30min、3 周后活检部位病理改变以及 2 天、2 周、4 周时软骨、滑膜细胞的变化。结果 纯氧和低浓度（10g/ml）臭氧对骨骼肌细胞无明显影响，高浓度（30、50、80g/ml）臭氧对 会造成肌细胞变性甚至轻度萎缩。臭氧 10g/ml组光镜下软骨、滑膜细胞未见明显 异常；30g/ml 组显微镜下软骨细胞无肿胀，少量软骨、滑膜细胞增生；50g/ml 组显微镜下软骨、滑膜 细胞稍肿胀；80g/ml 组软骨表面粗糙，有浆细胞浸润。结论 浓度为 30-80g/ml 的臭氧肌肉注射后会产生轻度损伤，浓度为10g/ml 的臭氧 对骨骼肌没有明显损害作用；50g/ml 以上 时，对软骨、滑膜细胞产生损伤， 80g/ml浓度的医用臭氧出现组织结构破坏，30g/ml 以下的臭氧关节内注射是安全的。关键字：臭氧 骨骼肌 软骨 滑膜细胞 骨性关节炎骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是关节炎中最常见的一种疾病, 老年人多见。以关节软骨的变性、破坏及骨 质增生为特征。关 节疼痛和功能障碍，严重影响患者的生活质量。常用保守治 疗或关节置换，前者 虽然可以改善症状，但存在一定的副作用，后者虽能治愈，但是价格昂贵而且手术有 风险， 远期效果也不确定。因此，新型疗法的目标应包括高效、安全、 简便、 经济。臭氧具有良好的镇痛作用，可以灭活或抑制蛋白水解酶和炎性细胞因子，减轻炎症；同时，臭氧可以诱导产生抗氧化酶，使间质细胞和关 节软骨合成增多，并 抑制 缓激肽的释放及炎性介质PGs 的合成，从而减 轻疼痛；臭氧还可以促进免疫抑制因子的释放，抑制免疫性反应。臭氧的这些作用与骨关 节炎发病机制密切相关，因此，作者不由得提出 这样一个假设：是否可以利用臭氧来治疗骨关节炎？本实验对此问题进行初步的探讨，了解 不同浓度医用臭氧 对大鼠骨骼肌、滑膜及 软 骨的影响。材料与方法实验动物Wistar 大鼠 30 只，体重 160220 g，复合饲料喂养（由南方医科大学实验动物中心提供）随机均分为 5 组，对照组注射医用纯氧，其它 4 组在大鼠臀大肌、关节腔内穿刺都分别注射臭氧 10g/ml、30g/ml、50g/ml、80g/ml，每次 1ml，1 次/周，共 3 次。实验仪器臭氧发生器（Humazon Promedic）； Olympus 光学显微镜；组织切片分析系统；550 nm 分光光度计。方法15330 只 Wistar 大鼠随机均分为 5 组， 对照组注射医用 纯氧，其它 4 组在大鼠臀大肌、关节腔内穿刺都分 别注射臭氧 10g/ml、30g/ml、50g/ml、80g/ml，每次 1ml，1 次/周，共 3 次。在不同时间点取活检光镜下病理检查。然后分别观察 5组大鼠骨骼肌注射臭氧 10min、30min、3 周后活检 部位病理改变(HE100)以及 2天、2 周、4 周 时软骨、滑膜 细胞的变化。具体标本取材方法：将大鼠麻醉固定于手术台上，切开皮肤及皮下组织，暴露关节囊，注意不要打开关 节囊。从 髌骨上囊部位注射入关节腔 200 ul 无菌的PBS，反复活动关节后，仔 细抽取灌洗液，必要时切小切口吸取，灌洗液置-20 保存备用。切取大鼠的实验侧 股骨内髁、 胫骨平台关 节软骨，修成 0.5 cm0.5 cm0.5 cm 大小 组织块，软 骨标本用 4%多聚甲醛固定，15%乙二胺四乙酸（EDA）脱钙 2 周，石蜡包埋，HE 染色，观察软骨形态学的 变化。统计学处理用 SPSS10.0 软件进行统计学处理，各组实验动物所有参数均数标准差表示，组间采用方差分析，显著性 t 检验。结果注射臭氧 10min 后（图 1），对照组与臭氧 10g/ml组的肌细胞无明显肿胀，细胞膜光滑完整，肌间隔有少量红细胞，无炎症 细胞浸 润。臭氧 30、50、80g/ml组的肌细胞轻度肿胀，边界稍模糊，肌间隙有少量红细 胞，无明 显炎症细胞浸润。注射臭氧 30min 后（图 2），对照组与臭氧 10g/ml组的肌细胞无明显肿胀，细胞膜光滑完整，肌间隔有少量 红细胞，无炎症 细胞浸润 。臭氧 30、50、80g/ml组的肌细胞部分出现变性，未见明显坏死；伴有肌细胞间隙和血管内炎症细胞浸润。注射臭氧 3 周后（图 3），对照组与臭氧 10g/ml组的肌细胞大小正常，无变 性坏死细胞膜光滑完整，无细胞浸润。 臭氧30、50、80g/ml组的肌细 胞轻度萎缩，部分伴有玻璃样变，有 纤维组织增生。臭氧 10g/ml组 ，2 天、2 周、4 周时软骨、滑膜 细胞未 见明显异常。臭氧 30g/ml组（图 4 a,b,c），2 天时软骨、滑膜细胞未见异常， 2 周后 软骨表面较规则，滑膜 组织内少量、散在的浆细胞浸润 ，4 周后软骨细胞无肿胀 ，少量 软骨、滑膜细胞增生。臭氧 50g/ml组（图 5 a,b,c），2 天后见软骨、滑膜细胞稍肿胀，2 周后见软骨细胞增生，滑膜组织内浆细胞浸 润，散在的炎 细胞，4 周后 见软骨表面粗糙，滑膜细胞增生，有浆细胞浸润，少量纤维组织增生。臭氧 80g/ml组（图 6 a,b,c），2 天后见滑软骨细胞稍肿胀，滑膜细 胞肿胀较明显， 2 周后软 骨、滑膜 细胞增生，纤维组织增生，部分见软骨细胞剥脱，4 周后软骨表面粗糙，软骨细胞增生，滑膜组织内有纤维增生， 浆细胞浸润。 讨论骨性关节炎(osteoarthritis OA)是一种慢性、系统性疾病，好发于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱等部位。 OA 以关节软骨的退行性变和继发性骨质增生为特点。目前国内外关于 OA 治疗主要集中在运动治疗、物理治疗、 药物治疗等对症治疗，但效果不理想，对肌力、运 动、关 节稳定性及日常活动能力等均会产生较大影响。如何阻断 OA 恶性循环是许多研究者一直探讨的问题。目前已经有研究表明臭氧有较好的止痛效果，改善膝关节的 ROM，总体上改善膝关节功能。相对理疗在减轻疼痛与改善膝关节整体功能效果较好。臭氧治疗是一种安全155有效的治疗方法。本实验采用不用臭氧浓度注射关节，探讨治疗浓度对骨骼肌、滑膜及软骨的影响，以便得到更加科学和规范的浓度标准。本实验研究显示：10 g/ml 医用臭氧组对骨骼肌细胞、软骨和滑膜细胞无明显影响， 较纯氧组无明显差异。臭氧 30g/ml组的骨骼肌细胞有轻度萎缩，对软骨细胞无明显影响，只有少量 软骨、滑膜 细胞增生。50g/ml 臭氧对骨骼肌有轻度影响。开始时，软骨、滑膜 细胞稍肿胀。随后，软骨细胞增生，滑膜组织内浆细胞浸润，有散在的炎细胞。最后，软骨表面粗糙，滑膜细胞增生，有浆细胞浸润，少量纤维组织增生。80g/ml 臭氧对骨骼肌影响较大，部分细胞有玻璃样变，并有纤维组织增生，较 50g/ml 臭氧对滑膜和软骨影响较大，滑软骨细胞稍肿胀，滑膜细胞肿胀较明显，随后 软骨细胞增生，并部分脱落，最后 软骨表面粗糙，软骨细胞增生，滑膜组织内有 纤维增生， 浆细胞浸润。 分析表明，浓度为 10g/ml的臭氧对骨骼肌没有明显损害作用；浓度为 30-80g/ml 的臭氧肌肉注射后会产生损伤；50g/ml 以上时，对软骨、滑膜细胞产生损伤， 80g/ml浓度的医用臭氧出现组织结构破坏。因此， 30g/ml 以下的臭氧关节内注射是安全的。 本实验初步观察了不同浓度医用臭氧对大鼠骨骼肌、滑膜及软骨的影响。如果要进行更为全面的观察，尚需研究骨性关节炎生化指标的变化及远期临床疗效的评价，同时还需更加深入的进行作用机理方面的研究。参考文献1 余斌，何晓峰。关节内注射医用臭氧对大鼠膝退行性关节炎的影响J。中国矫形外科杂志，2008，Vol. 16, No.11: 852-855.2王建华，李靖年。骨关节炎软骨损伤与修复的研究进展J.中国矫形外科杂志，2006，6：941-944.3 俞志坚，何晓峰，陈勇，等.臭氧对髓核超微结构影响 J.介入放射学杂志，2001，10：161-163.4 王贤波，蒋青.大鼠骨性关节炎模型的构建及其稳定性观察 J.中国临床康复杂志，2005，972-974. 5 Jiang HP, Wang DP.Osteoarthritis creataral model J.China Journal of Modern medicina，2004, 146: 153-156.6 Shinriki N,Suzuki Takama K,Fukunaga K,et al.Susceptiblities of plasma antioxidants and erythrocyte constituents to low levels of ozoneJ. Haematologia(Budap),1998,29:229-239.7 Bocci V, Valacchi G,Corradeschi F,et al.Study on the biological effects of ozone effect on the total antioxidant status and on interleukin-8 productionJ. Mediat Inflamm，1998，7:313-317.8 Richelmi P, Valdenassi L, Berte F.Pharmacological principles underlying oxygen-ozone therapyJ.Riv Neuroradiol, 2001,14:17-22.9 Bayram H,Sapsford RJ, Abdelaziz MM,et al.OA Effect of ozone and nitrogen dioxide on the release of proinflammatory mediators from bronchial epithelial cells of nonasthmatic subject and atopic asthmmation patients in vitroJ.J Allergy Clin Immunol,2001,107:287-294.10Mtyagi l,Kikuchi H,Hamantshi C. Auto destrcyio of the articular cartilage and free radical mediatorsJ.J Lab Clin Med,1998,131:146.11Akioka K, Shiratori R,Kaneko Y, et al.Mechanisms of action of ozone in matabolism in hemorrhagic shockJ.Nibon Untiv J Med,2002,44:123-133.12Andreula C,Kambas L.Lumbosacral pain from herniated lumbosacral discs and correlated degenerative diseaseJ.Rivi