工业微生物10

第四章第四章 病 毒本章内容 第一节第一节 概述概述 第二节第二节 病毒的形态结构与化学组成病毒的形态结构与化学组成 第三节第三节 噬菌体噬菌体 第四节第四节 真核细胞病毒真核细胞病毒 第五节第五节 亚病毒亚病毒 第六节第六节 病毒与发酵工业病毒与发酵工业第一节 概述 一、病毒的发现和研究历史一、病毒的发现和研究历史 二、病毒的定义与特点二、病毒的定义与特点 三、病毒的分类三、病毒的分类 四、病毒的培养与纯化四、病毒的培养与纯化病毒和我们的关系 “Virus”，它是由拉丁文中 “virus”一词演化而来，即 “有毒的物质 ” 第一节第一节 概概 述述一、病毒的发现和研究历史一、病毒的发现和研究历史1886年， A. Mayer 发现具有传染性的烟草花叶病；1892年， D. Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：一种能通过细菌滤器的 “细菌毒素 ”或 “极小细菌 ”1898年， M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：tt 能通过细菌滤器；能通过细菌滤器；tt 可被乙醇沉淀而不失去其感染性，可被乙醇沉淀而不失去其感染性，tt 能在琼脂凝胶中扩散；能在琼脂凝胶中扩散；tt 用培养细菌的方法不能被培养出来，用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活推测只能在植物活细胞中生活比细菌小的具有传染性的活的流质比细菌小的具有传染性的活的流质（ contagium vivum fluidum）1884年 Chamberland发明细菌滤器 1900年前后，包括口蹄疫（ foot and mouth disease） 在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。F W Twort （ 1915年）、 F dHerelle（ 1917年），分别发现细菌（ Shigella dysenteriae） 病毒 -噬菌体1935年， W M Stanley 首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年， Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒 .1952年， Hershey和 Chase利用同位素证实噬菌体的遗传物质是 DNA，将人类带入病毒的分子生物学阶段。 极大地丰富了现代生物学极大地丰富了现代生物学 （微生物学、分子生物学、（微生物学、分子生物学、分子遗传学）分子遗传学） 的理论与技术；的理论与技术；病毒学（病毒学（ virulogy） ：研究病毒（研究病毒（ virus） 的本质及其与宿主的相互作用的科的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。学，是微生物学的重要分支学科。有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业；非非细细胞胞生生物物至少含核酸和蛋白质二种组分至少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒亚病毒真病毒真病毒类病毒类病毒拟病毒拟病毒朊病毒朊病毒只含有不具侵染性的只含有不具侵染性的 RNA组分组分只含蛋白质组分只含蛋白质组分只含具侵染性的只含具侵染性的 RNA组分组分本章主要介绍真病毒本章主要介绍真病毒二、病毒的定义与特点二、病毒的定义与特点病毒：是一种结构简单，能够自我复制并具有侵染病毒：是一种结构简单，能够自我复制并具有侵染性的独特非细胞生物体。性的独特非细胞生物体。现代病毒学家把病毒这类非细胞生物分成真病毒（现代病毒学家把病毒这类非细胞生物分成真病毒（Euvirus，简称病毒）和亚病毒（，简称病毒）和亚病毒（ Subvirus）两大类：）两大类： 病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。病毒分两个阶段（以两种形式）存在：病毒分两个阶段（以两种形式）存在：胞外阶段：胞外阶段： “毒粒毒粒 ”形式形式 存在，可抵抗几乎所有酶的侵袭，存在，可抵抗几乎所有酶的侵袭，但不能独立于活细胞增殖；但不能独立于活细胞增殖；胞内阶段：胞内阶段： 主要以正在复制的主要以正在复制的 核酸形式核酸形式 存在，诱导宿主存在，诱导宿主细胞合成病毒组分；细胞合成病毒组分；毒粒：完整的病毒粒子毒粒：完整的病毒粒子（ virion），由蛋白外壳），由蛋白外壳包裹一个或多个包裹一个或多个 DNA或或RNA分子构成分子构成 特性特性1） 个体微小个体微小 ，在电子显微镜下才能看见；，在电子显微镜下才能看见；2） 不具有细胞结构不具有细胞结构 ，其主要成分为核酸和蛋白质，故称为，其主要成分为核酸和蛋白质，故称为“分子生物分子生物 ”；3） 一种病毒只含有一种病毒只含有 DNA或或 RNA一种类型的核酸一种类型的核酸 ；4） 绝对的细胞内寄生绝对的细胞内寄生 ，在细胞外不能增殖：既无产能酶系，在细胞外不能增殖：既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成的代谢系统合成自身的核酸和蛋白质；现成的代谢系统合成自身的核酸和蛋白质；5） 没有个体生长没有个体生长 ，不能进行细胞分裂，以核酸复制和蛋白，不能进行细胞分裂，以核酸复制和蛋白质合成、然后装配的过程实现其大量繁殖；质合成、然后装配的过程实现其大量繁殖； 7）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。6）在）在 离体条件下离体条件下 ，以无生命的生物大分子状态存在，并，以无生命的生物大分子状态存在，并 保保持其侵染性持其侵染性 ；三、病毒的分类三、病毒的分类 病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性。病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性。人们习惯根据其人们习惯根据其 宿主种类宿主种类 将病毒分类：将病毒分类：噬菌体（噬菌体（ phage） 真菌病毒（真菌病毒（ fungi viruses）植物病毒（植物病毒（ plant viruses） 动物病毒（动物病毒（ animal viruses）国际病毒分类委员会（国际病毒分类委员会（ International Committee for Taxonomy of Viruses,ICTV） 提出了分类依据和建立了分类系统。提出了分类依据和建立了分类系统。分类依据分类依据 核酸的特征、壳体的对称形式、有无包膜、宿主的种核酸的特征、壳体的对称形式、有无包膜、宿主的种类、引起的疾病种类、复制和释放方式等。类、引起的疾病种类、复制和释放方式等。命名规则命名规则 1996年国际病毒分类委员会提出年国际病毒分类委员会提出 38条新的病毒命名规条新的病毒命名规则，病毒分类系统依次用目、科、属、种分类等级。则，病毒分类系统依次用目、科、属、种分类等级。1）噬菌体的培养）噬菌体的培养1、病毒的培养、病毒的培养 (二元培养物法二元培养物法 )四、病毒的培养和纯化 噬菌斑（噬菌斑（ plaque）：）：将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后，在合适条件下培养一定时间后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，出现一个个肉眼可见的透明小圆斑。（ “负菌落 ” ）设 0.10mL稀释度为 10-6的病毒悬液可产生75个噬菌斑，则样品的噬菌斑形成单位为：PFU/mL=（ 75 PFU /0.10 mL ） （ 106）=7.5 1082）动物病毒的培养）动物病毒的培养动物病毒动物病毒实验动物实验动物鸡胚鸡胚多种细胞培养多种细胞培养在尿囊膜在尿囊膜上形成一上形成一些白色的些白色的庖痘（感庖痘（感染造成局染造成局部组织病部组织病损）损）感染感染若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（ plaque） 或称空斑。包涵体（包涵体（ inclusion body）：）：在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内，出现光学显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。多数位于细胞质内，如：痘病毒、狂犬病毒多数位于细胞质内，如：痘病毒、狂犬病毒少数位于细胞核内，如：疱疹病毒和腮腺炎病毒少数位于细胞核内，如：疱疹病毒和腮腺炎病毒有的既可在细胞质内，又可在细胞核内，如：麻疹病毒有的既可在细胞质内，又可在细胞核内，如：麻疹病毒包含体可以是病毒粒子的聚集体，如昆虫核型多角体包含体可以是病毒粒子的聚集体，如昆虫核型多角体病毒和质型多角体病毒的包含体；也可以是病毒结构蛋白病毒和质型多角体病毒的包含体；也可以是病毒结构蛋白与感染有关蛋白质等病毒组分的聚集体与感染有关蛋白质等病毒组分的聚集体多角体：多角体：核型多角体病毒（核型多角体病毒（ NPV）：是我国自主研究并应用于）：是我国自主研究并应用于农业实践的第一个病毒杀虫剂。农业实践的第一个病毒杀虫剂。 昆虫细胞内形成多角形包涵体，可作为病毒杀虫剂。昆虫细胞内形成多角形包涵体，可作为病毒杀虫剂。植物病毒植物病毒 敏感植物叶片敏感植物叶片被感染部位的细胞快速死被感染部位的细胞快速死亡而形成局部坏死斑，或亡而形成局部坏死斑，或称称 枯斑枯斑即便没出现坏死斑，被感即便没出现坏死斑，被感染的植物仍会表现一定的染的植物仍会表现一定的病症，如色素形成和叶子病症，如色素形成和叶子形状改变等。形状改变等。3）植物病毒的培养）植物病毒的培养（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）2、 病毒纯化病毒纯化标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性，标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性， 纯化的病毒制纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性备物的理化性质应具有均一性方法：主要化学组成为蛋白质，采用蛋白质提纯方法方法：主要化学组成为蛋白质，采用蛋白质提纯方法具有一定的大小、形状和密度，采用离心具有一定的大小、形状和密度，采用离心差速离心、梯度离心（超速离心）一、病毒的形态结构一、病毒的形态结构1、病毒的形状和大小、病毒的形状和大小个体小（测量单位 nm）， 必需在电镜下观察；不同病毒的毒粒大小差别很大（不同病毒的毒粒大小差别很大（ 10400nm）（ 1）大小）大小痘病毒：痘病毒： 300450nm 170260nm（ 最大）最大）双粒病毒：直径双粒病毒：直径 1820nm （最小）（最小）第二节第二节 病毒的形态结构与化学组成病毒的形态结构与化学组成（ 2）病毒的形态）病毒的形态弹状弹状 （狂犬病毒）、（狂犬病毒）、 砖块状砖块状 （痘病毒）、（痘病毒）、丝状丝状 （大肠杆菌（大肠杆菌 f1、 fd、 M13噬菌体）等噬菌体）等多形性多形性 （流感病毒，新分离的毒株呈丝状，（流感病毒，新分离的毒株呈丝状，在细胞内稳定传代后转变为拟球状）。在细胞内稳定传代后转变为拟球状）。基本形态：基本形态： 球形或拟球形球形或拟球形 （大多数动物病毒）；（大多数动物病毒）；杆状杆状 （植物病毒和昆虫病毒）；（植物病毒和昆虫病毒）；蝌蚪状蝌蚪状 （大肠杆菌（大肠杆菌 T偶数噬菌体）偶数噬菌体）其他形态：其他形态：各种毒粒的大小、形态差异很大各种毒粒的大小、形态差异很大蝌蚪状蝌蚪状 （大肠杆菌（大肠杆菌 T偶数噬菌体）偶数噬菌体）砖块状（痘病毒）砖块状（痘病毒）丝状（大肠杆菌丝状（大肠杆菌 M13）球状球状 (脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒 )衣原体衣原体大肠杆菌大肠杆菌红细胞红细胞杆状杆状 (TMV)基本构造：核衣壳(nucleocapsid) 非基本构造2. 病毒的基本结构病毒的基本结构 核心（核心（ core）：）： DNA或 RNA衣壳（衣壳（ capsid）：）： 蛋白质蛋白质包膜包膜 (envelope) ：脂蛋白或类脂、糖蛋白：脂蛋白或类脂、糖蛋白刺突刺突 (spike)：糖蛋白：糖蛋白核心 衣壳包膜刺突 衣壳粒（衣壳粒（ capsomere或或capsomer）：是组成衣）：是组成衣壳的蛋白质亚单位壳的蛋白质亚单位 3.几种典型病毒衣壳的结构几种典型病毒衣壳的结构 螺旋对称衣壳病毒：烟草花叶病毒 病毒可以根据衣壳中衣壳粒的排列方式将其分为 3种：二十面体对称衣壳病毒：腺病毒 复合对称衣壳病毒： T4噬菌体 壳体外形如中空的蛋白质圆管，呈坚硬或柔韧状。由 2130个 相同的蛋白质亚基（ 158个氨基酸） 以逆时针方向螺旋状排列，形成一个长300nm， 内径 4nm， 外径 15nm的刚直中空柱。 ssRNA盘绕在壳体内面由亚基形成的沟内，与蛋白质亚基通过弱键结合。螺旋对称壳体病毒代表： TMV并非所有螺旋对称衣壳都像并非所有螺旋对称衣壳都像 TMV衣壳一样是刚直的，流衣壳一样是刚直的，流感病毒的感病毒的 RNA就包围在薄的、柔软易弯曲的螺旋壳体内，其就包围在薄的、柔软易弯曲的螺旋壳体内，其衣壳折叠在一起，外有包膜。衣壳折叠在一起，外有包膜。流感病毒二十面体对称壳体病毒二十面体对称壳体病毒衣壳有 20个等边三角形面， 12个顶角。包括 12个五邻体（分布在 12个顶角上的衣壳粒）和 240个六邻体（分布在棱上和面上的非顶角衣壳粒）。核心为线状双链 DNA(dsDNA)，核酸分子以高度卷曲的状态存在于衣壳内。 代表：腺病毒代表：腺病毒五邻体六邻体二十面体衣壳在形成时通常是由五边形衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六邻体）组成的 （参见 P74） 其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。线状 dsDNA折叠盘绕于头部的核心。复合对称衣壳病毒复合对称衣壳病毒 代表：大肠杆菌的 T偶数噬菌体头尾髓颈环尾鞘尾丝刺突基板1、 病毒的核酸病毒基因组大小差别很大最小的基因组（ MS2病毒， QB病毒）只有 1 106 Da，仅够编码 34种蛋白质，这些病毒利用重叠基因来节省空间。最大的基因组（ T偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达 1.6 108 Da， 可编码 100多种蛋白质。二、病毒的化学组成二、病毒的化学组成单链 DNA（ ss DNA）；双链 DNA（ ds DNA）；单链 RNA（ ss RNA）；双链 RNA（ ds RNA）4种类型动物病毒这动物病毒这 4种类型都有；植物病毒通常含有种类型都有；植物病毒通常含有 ssRNA； 噬菌体噬菌体通常为通常为 ds DNA， 但也有一些噬菌体为但也有一些噬菌体为 ss DNA或或 ss RNA。(1) DNA病毒 dsDNA：大多数：大多数 DNA病毒以病毒以 dsDNA作为遗传物质。许多病毒作为遗传物质。许多病毒dsDNA经过修饰经过修饰 ,呈线性，少数为环状呈线性，少数为环状 dsDNA。特殊的碱基：除常见核苷酸外，许多病毒具有特殊的碱基，如，大肠杆菌 T偶数噬菌体以 5-羟甲基胞嘧啶 代替胞嘧啶。 噬菌体的线性噬菌体的线性 dsDNA: 有由有由 12个氨基酸组成的粘性末端，粘个氨基酸组成的粘性末端，粘性末端配对可使性末端配对可使 DNA环化。环化。ssDNA: 少数，如少数，如 X174、 M13噬菌体等，有线性和单链闭噬菌体等，有线性和单链闭合环状合环状 DNA两种。两种。(2) RNA病毒 多数多数 RNA病毒以病毒以 ssRNA作为它们的遗传物质。作为它们的遗传物质。正链或阳性链：正链或阳性链： RNA碱基序列与病毒碱基序列与病毒 mRNA相同，指导相同，指导蛋白质合成。如：脊髓灰质炎病毒，等蛋白质合成。如：脊髓灰质炎病毒，等负链或阴性链：病毒负链或阴性链：病毒 RNA基因组与病毒基因组与病毒 mRNA互补。如互补。如：狂犬病毒，等。：狂犬病毒，等。片段基因组：许多片段基因组：许多 RNA病毒基因组被分为独立的片断，病毒基因组被分为独立的片断，每个片段编码一种蛋白。有的病毒基因组可以分为每个片段编