【大学课件】医学微生物学

逆转录病毒Retroviridae病原生物学教研室 逆转录病毒的分类及其代表病毒亚科名 代表病毒RNA肿瘤病毒亚科 (爬虫类 )蛇病毒(禽类 )rous肉瘤病毒 (RSV)、 rous 相关病毒 (RAV)、 其他鸡肉瘤病毒、禽白血病病毒 (ALV)(哺乳类 )鼠肉瘤病毒 (MSV)、 鼠白血病毒 (MLV)、 鼠内源性病毒、猪肉瘤病毒、牛白血病病毒、猪白血病病毒、鼠乳腺瘤病毒(灵长类 )灵长类肉瘤病毒、猴白血病病毒、狒 C型肿瘤病毒、 mason-pfizer猴病毒 (MPMV)、 langur病毒(人）人类嗜 T细胞病毒 型、 型、 型 (HTLV- 、 、 )慢病毒亚科 人类免疫缺陷病毒 (HIV)、 绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒 ( visnavirus)、 绵羊肺腺瘤病毒 (maedi virus)、 马传染性贫血病毒 (EIAV)泡沫病毒亚科 灵长类泡沫病毒、猫、牛、人泡沫病毒 (human foamy virus)逆转录病毒的共同特性 ：1.病毒为球形，有包膜，表面有刺突， (与病毒的吸附和穿入有关 )。2.基因组为单正链 RNA双体结构。3.病毒体含逆转录酶。4.具有 gag、 pol、 env三个结构基因。5.病毒增殖的突出特点是在复制病毒 RNA时要通过 DNA复制中间型 (DNA replicative intermediate)。 并与宿主细胞的染色体整合。第 1节 人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)是 获得性免疫缺陷综合征 (acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的病原体，俗称 艾滋病 。HIV主要有两型 ：HIV-1型 ：即通常称谓的 HIV， 世界上的 AIDS多由 HIV-1所致；HIV-2型 ： 1986年在西非发现一种与 HIV-1不同的逆转录病毒，两者的核苷酸序列差异超过 40%，称为 HIV-2型，只在西非呈地区性流行。生物学性状形态结构核衣壳 核酸 ： 两条 ssRNA与核衣壳蛋白 (P7)结 合形成双体 结 构 衣壳 ：双层壳膜 内层为衣壳蛋白（ P24)外层为内膜蛋白（ P17)包 膜 脂质双层刺 突 gp120,gp41 生物学性状形态结构病毒基因组全长约 9200bp， 其 5端和 3端各有一段相同的核苷酸序列，是长末端重复序列 (LTR)， 中间含有 env 、pol、 gag 3个结构基因和 tat、rev、 nef、 vif、 vpu、 vpr等 6个调节基因 。生物学性状基因组结构与功能结构基因env基因 ：编码 gp41： 介导病毒包膜与宿主胞膜的融合；gp120： 有病毒颗粒与 NT抗体及宿主细胞表面的 CD4分子结合的部位。pol基因 ：编码产生 逆转录酶 (p66/ p53)和 整合酶 (p31)， 与病毒的复制有关。gag基因 ：编码产生蛋白前体，经酶解后形成 3种蛋白 (P17、P24、 P15)。调节基因： tat、 rev、 nef、 vif、 vpu、 vprtat、 rev和 nef的产物对 HIV表达的正、负调节以及对维持HIV在细胞中复制平衡和控制 HIV潜伏有重要意义。长末端重复序列 (LTR)： 对 病毒转录的调控起关键作用。生物学性状基因组结构与功能HIV病毒体的包膜糖蛋白刺突与细胞上的特异受体结合，然后病毒包膜与细胞膜发生融合。核衣壳进入细胞质内脱壳，释放其核心 RNA进行复制。病毒的复制 生物学性状病毒变异性 HIV基因组可发生变异， 最易变异的是编码包膜糖蛋白的 env基因和调节基因 nef。估计病毒 env基因核苷酸变异概率每年每个位点约0.1%，其变异率与流感病毒相似。根据 nef基因序列的异同将 HIV-1分为 M、 O、 N等 3组(group)12个亚型 (subtype)； HIV-2型为 A F等 6个亚型。在非洲主要流的是 HIV-1的 A、 C、 D、和 E亚型，我国云南省感染者主要为 B和 C亚型。全球流行将以 C和 E亚型为主，另外各亚型的流行时间和传播情况也不同。生物学性状HIV仅感染表面有 CD4受体的细胞。实验室中常用正常人 T细胞分离病毒。感染病毒的细胞出现 CPE。 动物模型可用 HIV感染恒河猴和黑猩猩。 培养特性生物学性状1) 56 加热 30min；2) 冻干血制品需 68 72h方能保证污染病毒的灭活；3) 高压蒸气灭菌（ 103.4kpa/121.3 ） 20min可被灭活 ；4) 10%漂白粉液、 0.5%次氯酸钠、 50%乙醇、 35%异丙醇、 0.3%H2O2、 0.5%来苏等消毒液中室温 10min保证完全被灭活。 抵抗力HIV的抵抗力不强，以下条件可被灭活：生物学性状致病性与免疫性传染源和传播途径传染源 a） HIV无症状携带者 b） 艾滋病患者2） 血液传播：医源性吸毒者1） 性传播： STD之一同性恋异性恋传播途径3） 母致病性与免疫性婴传播：胎盘产道哺乳临床表现1)原发感染致病性与免疫性HIV进入机体后病毒开始复制，约在 8 12w时出现病毒血症，此期病毒在体内广泛播散，并开始在淋巴样器官种植， 3 6w在许多病人（50% 70%）体内发展成急性单核细胞增多症样表现，其后大多数病毒以前病毒的形式整合于宿主细胞染色体内，进入长期的、无症状的潜伏感染期。 2) 潜伏感染致病性与免疫性此期可长达 6个月至 10年。临床无症状，有些病人可出现无痛性淋巴结肿大。当机体受到各种因素的激发使潜伏感染的病毒再次大量增殖而引致免疫损害时，才出现临床症状，进入 AIDS相关综合征期。 临床表现3)AIDS相关综合征致病性与免疫性临床表现(AIDS-rilated complex,ARC) 早期有发热、盗汗、全身倦怠、体重下降、皮疹及慢性腹泻等胃肠道症状，并有进行性淋巴结病及舌上白斑等口腔损害。 4)典型 AIDS致病性与免疫性临床表现 出现中枢神经系统疾患 ;合并各种条件致病菌 (如分枝杆菌、念珠菌、卡氏肺孢菌等 )或其他病毒 (如 EBV， CMV、 HHV-8型等 )感染；并发卡波济肉瘤 (Kaposi sarcoma) 。在感染后 10年内约有 50%的人会发展为 AIDS。 AIDS的 5年间死亡率约为 90%，多于临床症状出现后 2年内死亡。 HIV的致病机制1）选择性地侵犯 CD4+T 细胞， CD4/CD8比例倒置，导致免疫功能紊乱。2） HIV感染后 B细胞多克隆活化，出现高丙球蛋白血症，循环血中免疫复合物及自身抗体含量增高，但对新抗原刺激的应答受到很大阻碍。3）单核巨噬细胞也表达少量 CD4分子，受 HIV感染后通常不被杀死，成为感染后较长时期的病毒储存者。4） HIV感染所致神经细胞损害：约有 40 90的 AIDS患者出现不同程度的神经异常，包括 HIV脑病、脊髓病变、周围神经炎和严重的 AIDS痴呆综合征。致病性与免疫性HIV对 CD4+T 细胞损害的 机制1） 病毒感染对细胞的直接杀伤作用a.病毒包膜糖蛋白插入细胞膜或病毒的出芽释放，增加了细胞膜的通透性；b.HIV增殖时可产生大量未整合的病毒 cDNA,干扰细胞的正常生物合成；c.感染 T细胞表面的 gp120与非感染细胞的 CD4结合，细胞融合死亡， T细胞减少。2)免疫病理所引起的细胞损伤：a.受染细胞膜上表达病毒的包膜糖蛋白 ， 可激活特异性 CTL的识别，或与特异性抗体结合后通过 ADCC作用而破坏细胞；b.HIV的 gp120与细胞膜上的 MHC 类分子有一同源区，抗 gp120抗体能与这类T细胞起交叉反应，即病毒诱导的自身免疫使细胞造成免疫病损害或功能障碍。3)HIV感染诱导细胞凋亡：病毒激活 T细胞凋亡基因，表达 FAS受体，当其与细胞表面 FAS结合后最终导致感染细胞死亡。 致病性与免疫性3.机体对 HIV感染的免疫应答机体感染 HIV后产生多种抗体，包括抗 gp120等中和抗体。 HIV感染也可刺激机体细胞产生免疫应答，包括 CTL细胞、NK细胞及 ADCC的杀伤活性，但细胞免疫依然不能清除有 HIV潜伏感染的细胞，这与病毒能逃逸免疫作用有关，如 :1) HIV损伤 CD4细胞，使整个免疫系统的功能失效；2) 病毒基因整合于宿主细胞染色体中，细胞不表达或少表达病毒结构蛋白，使宿主长期呈 “无抗原状态；3) 病毒包膜糖蛋白的一些区段的高变异性，致使不断出现新抗原而逃逸免疫系统的识别；4) HIV对各种免疫细胞均有损害。故表明机体的免疫力不足以清除病毒， HIV一经感染便终生携带病毒。致病性与免疫性HIV感染早期呈病毒血症时，从病人血液、脑脊液和骨髓细胞中能分离到病毒，从血清中查到 HIV抗原；无症状的潜伏期内一般不能或很少从外周血中检测到 HIV抗原； 进入 AIDS相关综合征或典型 AIDS期，于外周血中均可查到病毒抗原、核酸及抗体。微生物学检查法检测抗体ELISA、 IFA、 RIA: 敏感性好，应用方便。尤其ELISA法目前最为常用。但由于 HIV的全病毒抗原与其他逆转录病毒（ HTLV） 有交叉反应，而且病毒系芽生释放，病毒包膜中常带有细胞成分，故有一定的假阳性。因此，这类试验仅适用于筛查 HIV抗体 .Western Blot（ WB） : HIV抗体阳性者进一步用WB法予以确认。微生物学检查法检测病毒及其组分1) 病毒分离 ：取新鲜分离的正常人淋巴细胞或脐血淋巴细胞接种病人的 血液单个核细胞、骨髓细胞、血浆或脑脊液等标本。培养 2 4周，细胞病变出现后，可用间接免疫荧光法检测培养细胞中的病毒抗原，或用生化方法检测培养液中的逆转录酶活性。2) 检测病毒抗原 ：常用 ELISA法检测衣壳蛋白。 P24多出现于 HIV感染的急性期，而在潜伏期中为阴性，到出现典型的艾滋病症状时， p24 又可重新升高。3) 检测病毒核酸： 应用核酸杂交法检测整合在细胞中的前病毒DNA片段，可确定细胞中 HIV潜伏感染的情况。应用 PCR检测HIV的前病毒 DNA， 或用逆转录 -PCR法检测病毒的 RNA。微生物学检查法防治原则WHO和包括我国在内的许多国家都制定了控制 HIV感染的措施： 建立 HIV感染和 AIDS的监测网络，控制疾病的流行蔓延； 进行广泛的宣传教育，取缔娼妓，防止性传播疾病的流行，抵制吸毒等社会弊病； 检测高危险人群包括供血员、同性恋、静脉注射毒品成瘾者、血友病患者，国外旅游者和外事使馆人员等； 禁止进口血液制品，如凝血因子 等； 加强国境检疫、留检等。疫苗研究 尚缺乏理想的疫苗 ,目前研究得最多的是：1.基因工程亚单位疫苗 : HIV的包膜糖蛋白 gp160,gp120和gp41已在细菌、酵母和真核细胞系统表达成功，免疫人和动物后可诱生特异性中和抗体和激发特异性 T细胞免疫反应，在黑猩猩实验中已证明有保护作用。 2.合成寡肽疫苗 根据 gp120分子中的主要中和决定簇（ V3区）、与 CD4受体结合区（ C4区）和部分 T细胞决定簇（ C1、 C4区）的氨基酸顺序，合成各种 HIV的寡肽疫苗。在实验中已证明 V3肽可以刺激动物和人产生抗 HIV的中和抗体和细胞毒 T细胞反应。 3.重组病毒载体活疫苗 用痘苗病毒、腺病毒和脊髓灰质炎病毒疫苗株作载体，将 HIV基因插入构建成重组病毒载体疫苗。动物试验已证明能产生特异性细胞免疫和中和抗体。用表达HIVgp160、 gp120蛋白的重组疫苗病毒接种志愿者后，可以产生较强的 T细胞免疫反应，但体液免疫相对较弱。 防治原则AIDS的治疗 阻止 HIV吸附穿入的 重组可溶性 CD4分子 (rsCD4)的使用； 给予抑制病毒逆转录酶活性的 核苷类似物 如叠氮胸苷(azidothymidine,AZT),双脱氧肌苷 (2， ,3， -dideoxyinosine,DDI)与 2， ,3， -双脱氧肌苷 (2， ,3， - dideoxyinosine,DDC)等； 非核苷类逆转录酶抑制剂 ，如德拉维拉丁 (Delaviradine)和耐维拉平 (Nevirapine)等，国内多用施多宁； 近年来研制的 蛋白酶抑制剂 ，如佳息患、赛科纳瓦 (sapuinavir)、 瑞托纳瓦 (ritonavir)以及英迪纳瓦 (indinavir)等； 免疫调节剂 ，如 IFN- ， IL-2和胸腺素等。“ 鸡尾酒疗法 ” ：联合交替使用 2种 HIV逆转录酶抑制剂和 1种 HIV蛋白酶抑制剂，可有效地把血液中的 HIV含量减少到最低 (外周血中测不出 HIV或其 RNA)， 因而能减轻症状及延缓生命。但无法清除整合在 CD4+细胞染色体上的前病毒，因此仍不能从体内彻底清除 HIV。 防治原则第 2节 人类嗜 T细胞病毒在逆转录病毒中大部分属于 RNA肿瘤病毒，感染细胞后不引起 CPE， 而是引起细胞转化，诱发肿瘤。1978年从 T细胞白血病患者的淋巴结和外周血淋巴细胞中，观察到一种有中央位类核的 C型病毒颗粒，命名为 人类嗜 T细胞病毒 (Humun T-cell lymphouopic nirus, HTLV)或人类 T细胞白血病病毒 (Human T-Cell laukemia mirus, HTLV)。后从 1例毛细胞白血病患者的外周血中分离