生物样本分析

生物样本分析岛津 自动前处理 系统（ Co-Sense for BA LCMS ）药 代动力学研究的内容药代动力学应用动力学原理研究药物吸收、分布、代谢和排泄过程。 药物剂量与药理效应的相互关系研究 人体生理及病理状态对药物体内过程的影响 药物制剂的生物利用度测定 药物相互作用评价生物样品包括各种体液和组织血浆中微量药物或代谢产物的测定药物化学结构的特点世界药物索引 1999收载药物总数： 51596可离子化药物： 62.9%，其中酸性化合物 14.5%碱性化合物 67.5%两性化合物 18.0%分子量一般 500 离子化 质谱分析血浆样品的特点基质复杂 选择性强待测物含量低 灵敏度高浓度差异大 线性范围宽生物样品中的药物分析前处理的要点除蛋白质，分离纯化浓缩液液萃取法 固相萃取法 规模缩小的柱色谱法直接沉淀法 超滤法血浆样品加入提取溶媒（酸化或碱化）涡旋离心取上清液吹氮气浓缩残渣溶解过滤进样色谱分析样本前处理一般步骤药代动力学研究面临的挑战高效液相色谱法（ HPLC） 的特点和局限： 灵敏度：定量限一般为 10 100 ng/ml， 选择性差 测试速度：每个样品 15 20 min， 低通量 对结构分析提供的信息很少需求： 灵敏度： ng/ml 浓度，高选择性 制剂生物等效性实验： 500 1000 样品 新药研究：分析超过 10000 个生物样品液相色谱 -质谱联用法的发展1977年， LC/MS开始投放市场1978年， LC/MS首次用于生物样品分析1991年， API LC/MS用于药物开发数据来源： American Society for Mass Spectrometry, 2002药物色谱分析中不同方法的比例1990年 2000年LC/MS 法测定人血浆中克拉霉素的浓度 克拉霉素 (clarithromycin) 红霉素衍生物新一代对酸稳定的口服大环内酯类抗生素 以往克拉霉素血药浓度测定多采用微生物法HPLC紫外检测 克拉霉素检测 条件 流动相 : 0.05%冰醋酸和乙腈（ 4060 v/v）流速 : 0.2mL/min色谱柱 : Shim-pack ODS 150mm2.0 mm I.D. 5 m 柱温 : 40质谱离子化方式：电喷雾离子化（ ESI）离子极性 :Positive；选择性离子检测 (SIM): 克拉霉素 m/z: 748.5M+H+罗红霉素 m/z: 837.5 M+H+ 内标物14-羟基克拉霉素 m/z: 764.5M+H+血浆样品的处理血浆 样品 , 内标罗红霉素 , 碳酸钠溶液 碱化后 乙醚 提取 , 上清液用氮气吹干。 最后 残渣乙腈溶解。方法的专属性克拉霉素、内标、 14-羟基克拉霉素的保留时间分别为 1.93min、 1.93min、 1.92min岛津 自动前处理 系统（ Co-Sense for BA LCMS ）内容 自动前处理的优点与问题 自动前处理系统 Co-Sense for BA的特长采用新型色谱柱和稀释系统实现了高回收率 使用新型色谱柱的自动浓缩系统实现了高灵敏度 Co-Sense for BA + LCMS系统的特长背景p 样品前处理是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难点和热点问题之一。由于样品数量极多，且分析物含量越来越低、基体越来越复杂，迫切要求发展高通量、高选择性、高效率的在线样品前处理技术。因此，开展这方面的研究具有极为重要的意义。HPLC/LC-MS广泛应用于血浆或血清的代谢物分析和原药分析，一般的血浆和血清分析，需要对样本进行预处理，以除去蛋白质，这样会降低精确度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（ restricted access media -RAM） 的预柱，可对血浆样本进行直接分析，而不必进行预处理。这样，可提高精确度、简化操作和提高工作效率 。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些问题，需解决的问题：回收率、灵敏度、耐用性 。生物样品中的药物分析前处理的要点除蛋白质浓缩手工前处理的问题处理时间重现性药物回收率前处理的现状除蛋白、浓缩操作自动化的优点提高分析精度脱线处理时，难以保持操作完全一致，有时分析精度变差。提高操作简便性脱线处理时需操作熟练提高处理效率夜间可自动运行，大幅度地提高了处理效率前处理自动化的课题提高回收率及提高浓缩率自动前处理的优点和课题提高回收率的手段p 有必要使与蛋白质结合的药物游离出来n 与蛋白质结合的药物，在除蛋白质处理时，药物也与蛋白质一起被除去，药物回收率降低。p 切断蛋白质结合（离子结合，疏水结合 ）n 调整样品导入溶液的 pH值p 碱性药物时，使用 pH值低的溶液 p 酸性药物时，使用 pH值高的溶液 n 调整样品导入溶液的离子强度p 20-100mM的缓冲液浓度n 在样品导入溶液中添加有机溶剂p 在 20%以内使用有机溶剂（防止由蛋白质的变性而产生的析出）p 使用界面活性剂(*) 从药物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制药离子化的 pH值较为理想。方法我们研究开发出优质的限制性通路媒介（ RAM） 预柱，应用柱切换 HPLC系统及其在线稀释旁路系统 ， 可对血浆直接进行药物分析。我们的系统 . 回收率即使是紧密与蛋白质结合的化合物，也能被预柱吸附（捕集）， 并且回收率几乎达到 100%灵敏度目标化合物可进行浓缩和分离即使是大体积进样分析也如此 。不会造成峰值恶化。耐用性新设计的涂渍技术和粒径优化技术，使得数据保持稳定，即使是 长时间的实验也能如此。Co-Sense for BAp 何谓 Co-Sense for BAn 用于分析生物样品的应用系统p 具有在线稀释旁通流路的自动前处理系统和新开发的前处理柱p Shim-Pack MAYl-ODS的组合，实现了真正的血浆（血清）的直接大量注入。p 特长n 可对应蛋白质结合率高的药物p 使用样品导入用溶液的在线稀释的应用，即使是蛋白质结合率高的药物且在大量注入时也可有效地捕集，回收率几乎 100%。n 超高速进样和无限接近零的交叉污染。-使用高效自动进样器n 迅速且有效地除去蛋白p 有效地保护分析柱色谱柱和 LC/MS的接口n 经久耐用的新型柱通过采用新开发的涂覆技术和粒子径的最优化，可得到长期稳定数据 。自动前处理系统的基本流路泵 1泵 2前处理柱 分离柱自动进样器检测器流动相导入溶液自动前处理系统的基本流路泵 1泵 2前处理柱 分离柱自动进样器检测器流动相导入溶液通过对样品导入溶液进行最优化，可提高回收率。但是，为了提高浓缩效果而大量进样时的回收率会怎样呢？血浆（血清）样品的大量进样时的回收率？p 因大量进样，回收率降低。p 通过安装在线稀释旁通流路，可大量注入血浆（血清）样品。这便是 Co-Sense的关键技术！自动进样器 前处理柱在线稀释流路导入泵在线稀释流程图样品处理柱的容量 进样体积对色谱图的影响 当进样体积加大的时候，由于样品处理柱子容量的限制会发生峰展宽的现象 .100 uL50 uL10 uL100 uL50 uL10 uL不同进样体积的影响10 uLDrug Protein100 uL 小体积进样的时候，预处理柱可捕集几乎所有的药物分子 大体积进样的时候，部分药物被蛋白带走，回收率降低在线稀释泵提高回收率的原因Auto-samplerPretreatment columnSample introduction pump在样品进入预处理柱之前，在线稀释泵可预先将蛋白和药物分子分离Auto-samplerPretreatment columnSample introduction pump90%10%Free DrugDilution pumpShim-pack MAYI-ODS （ RAM） 预处理柱p 采用