VEGF的生物学基础与朗沐药学PPT课件

VEGF生物学基础与朗沐药学基础知识目录VEGF的生物学基 础康柏西普的 药 学基 础VEGF的定义VEGF： Vascular Endothelial Growth Factor，血管内皮生长因子，是一类多功能的细胞因子，在血管生成和淋巴管生成中具有直接和间接的调控作用。VEGF主要有 7种亚型： VEGF-A， VEGF-B，VEGF-C， VEGF-D， VEGF-E， VEGF-F和PlGF（ Placenta Growth Factor）。其中只有 VEGF-A， VEGF-B和 PlGF与血管新生相关。VEGF的分子结构VEGF-A的基因经过剪切拼接后可形成不同单体，如 121, 165,183等。数字代表相应的氨基酸残基数量。其中 VEGF165是眼部新生血管的 主要诱因 。VEGF通常以同源二聚体的形式存在， 2个亚基的分子质量（MW ）为 17 23 kDa，通过两对二硫键共价连接。 kDa: kiloDalton，千道尔顿，也写作 kD。VEGF的合成和靶细胞所有眼部分布血管的组织都可合成表达VEGF，相关细胞包括：视网膜色素上皮细胞（ retinal pigment epithelium， RPE），周皮细胞（也称周细胞），内皮细胞，穆勒细胞和基质细胞等。VEGF的主要靶向细胞为血管内皮细胞RPE 视 网膜外 层 穆勒细 胞 视 网膜中 层视 网膜内 层视 网膜感 觉 神经细 胞VEGF的作用1. VEGF可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和存活；2. VEGF可以增加血管通透性，扩张血管；3. VEGF可以聚集血管前体细胞和单核细胞。VEGFR的定义VEGFR： Vascular Endothelial Growth Factor Rceptor，血管内皮生长因子受体，是一类受体酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，与 VEGF结合后通过构象变化和磷酸化传递相应信号。VEGFR主要有 3种亚型： VEGFR-1， VEGFR-2和 VEGFR-3。VEGF刺激内皮细胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通过结合和激活VEGFR-2来实现的。 VEGFR-3不参与血管新生信号通路中。VEGF受体的分子结构VEGFR平时以单体形式存在。分为胞外区、跨膜区和胞内区三大部分。胞外区部分由 7个与免疫球蛋白（immunoglobulin， Ig)结构相似的结构域组成。胞内区部分属于酪氨酸激酶区，可以发生自磷酸化来向下游传递信号。VEGF受体的分子结构VEGFR的胞外区的 7个免疫球蛋白样结构从 N端开始依次命名为 D1-D7。VEGFR-1（ Flt-1）可以结合 VEGF-A、 VEGF-B和 PlGF，其 D2区就是与配体结合的位点。VEGFR-2（ KDR， Flk-1）只能结合VEGF-A，其 D2和 D3区是配体结合位点， D3区对于配体结合的专一性起作用。 D4区对受体的二聚体化很关键，并可增强 VEGF与 VEGFR的结合速率。D1D7VEGF与眼部新生血管疾病有关 证据： 脉络膜新生血管膜中检测到 VEGF165 ，VEGF-B和 PlGF； PDR（增殖性糖尿病视网膜病变）患者的玻璃体腔中 PlGF的浓度明显升高； 眼内注射 VEGF会引起和 DR相同的表现，如微动脉瘤、出血、视网膜和虹膜新生血管。 以上说明， VEGF与眼部新生血管疾病有关：1. 从通透性到新生血管构建，视网膜脉管系统的病态改变都与 VEGF表达量增加有关。2. 仅需 VEGF就可触发眼内新生血管形成。3. 抑制 VEGF可改善眼部功能和结构。VEGF表达增加的诱因缺氧、炎症和机械力会上调细胞合成 VEGF。VEGF的作用机制VEGF结合到VEGFR，通过 D4区使其发生二聚体化现象，VEGF则桥接在受体的 D2区或者 D2和D3区之间。VEGF的作用机制VEGF与 VEGFR的结合会引发受体构象变化和自磷酸化，并使下游蛋白发生磷酸化，传递血管新生和血管渗漏的信号。PP眼部新生血管类疾病种类 VEGF诱发的病态性血管新生疾病主要分为两种：肿瘤和眼部新生血管失调。 眼部新生血管疾病根据临床表现又可分为三种：增殖型（Proliferation），渗漏型（ leakage）和增殖渗漏型（Proliferation and leakage）。 增殖型眼病：增殖型糖尿病视网膜病变（ PDR），早产儿视网膜病变（ ROP），新生血管性青光眼（ NVG） 渗漏型眼病：视网膜静脉阻塞（ RVO），糖尿病黄斑水肿（ DME），中心性浆液性脉络膜视网膜病变（ CSC） 增殖渗漏型眼病：湿性年龄相关性黄斑变性（ wAMD），视网膜血管瘤增殖（ RAP），病理性近视 CNV（ pmCNV）眼部新生血管类疾病的拮抗途径1.移除诱导 VEGF表达量增加的条件：全视网膜激光光凝术，玻璃体切割术 改善视网膜内氧环境，降低低氧诱导的 VEGF表达；2.下调 VEGF和 VEGFR的表达：眼内注射曲安奈德，地塞米松3.阻断 VEGF与 VEGFR的结合：哌加他尼钠 特异性结合 VEGF-A165；贝伐单抗，雷尼单抗 结合所有 VEGF-A；阿柏西普，康柏西普 结合所有 VEGF-A、 VEGF-B和 PlGF。康柏西普的生物学与药学基础康柏西普的来历l 抗 VEGF药物的阻断途径：l 1. 通过结合 VEGF使之不能再与 VEGFR结合l 2. 通过结合 VEGFR使 VEGF不能再与受体结合l 单抗类药物均采用了阻断途径 1l 通过杂交瘤细胞技术获得。VEGF-AVEGF-AVEGF-A贝伐单抗， Avastin 雷珠单抗， Ranibizumab雷珠单抗生产工艺 雷珠单抗和贝伐单抗最开始是以单克隆抗体技术制备筛选的。单克隆抗体技术又叫杂交瘤细胞技术，是融合了小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞来生产抗体的技术。因为小鼠脾细胞经过特定抗原（ VEGF）刺激后会产生分泌相应抗体（抗 VEGF抗体，如贝伐单抗），但是小鼠脾细胞不能繁殖，如果需要较多量的稳定单抗，就要把脾细胞与可以无限繁殖的肿瘤细胞进行融合，这样既可以分泌抗体又能保持细胞永生。由于 VEGF刺激的是小鼠脾细胞，因此产生的抗体无可避免都会有鼠源性的氨基酸序列。而且由于抗体的可变性，不同次的刺激可能产生不同的抗体，因此最后是在多种抗体中筛选出贝伐单抗和雷珠单抗的全体。然后对这两个单抗的氨基酸序列（雷珠是 Fab片段的序列）进行鉴定后即可根据基因密码子表获得相应的 DNA，然后将 DNA序列转入大肠杆菌中进行诱导表达，就能大批量培养获得稳定的雷珠单抗了。因为用大肠杆菌表达蛋白一般来说快速方便稳定又便宜。康柏西普的来历l 抗体存在两个问题：l 1. 抗体的高度特异性使其只能与 VEGF的一个亚型 VEGF-A结合，而不表现出对 VEGF-B和胎盘生长因子（ PlGF）的亲和力；l 2. 杂交瘤细胞技术生产的抗体部分氨基酸组成和序列是鼠源性的，而非全人源化蛋白。康柏西普的来历l VEGF的各亚型都通过结合 VEGFR-1和 2来发挥作用。l 模拟受体与 VEGF结合位点的结构，可降低免疫原性，并能与所有 VEGF亚型结合。l VEGFR-1和 2的胞外域是与 VEGF上的不同位点结合，因此这种模拟受体需要融合 VEGFR-1和 2两种蛋白的配体结合位点才能完全抑制 VEGF与受体的结合。康柏西普的来历l FP3表现出最高的 VEGF的亲和力，最强的抑制人脐静脉内皮细胞（ HUVEC）增殖的能力。VEGFR-1 VEGFR-2l 康柏西普的分子量约为 143kD,其受体样区域是同源二聚体样结构，很好地模拟了 VEGFR与 VEGF结合的活性形态l 康柏西普的 7个糖基化位点均发生糖基化，使得康柏西普的 pI值在5.68-7.47之间，对眼部刺激性小l D4区使得二聚体样结构更稳定更方便 VEGF的桥接，也具有更快的VEGF结合速度。康柏西普的结构康柏西普生产工艺 康柏西普最开始是从人 VEGF受体 1和受体 2的胞外免疫球蛋白样区域分别随机融合并连上人 IgG的 Fc片段形成的融合蛋白中筛选出来的，这种融合就是将表达这些蛋白区域的 DNA序列通过连接酶有序地连接在一起，再转入 CHO细胞中进行诱导表达即可获得。由于 DNA对应的蛋白均为人源化蛋白，因此康柏西普是 100%全人源化的蛋白。 之所以选用 CHO细胞，一是因为大肠杆菌中没有辅助真核蛋白正确折叠形成活性状态的酶，因此表达出的分子不可溶、无活性，而 CHO作为真核细胞，这些酶是有的；二是因为康柏西普蛋白上有多个糖基化位点，而大肠杆菌不能对人源化的糖基化位点进行糖基化，也会影响蛋白的状态和活性；第三是因为 CHO细胞表达技术是现在真核表达细胞中相对成熟稳定的技术，已经用于工业生产。康柏西普的活性研究l 康柏西普的体外活性研究l 康柏西普的体内活性研究 康柏西普的体外活性研究ELISA检测 FP1、 FP3和贝伐单抗对 VEGF的亲和力 FP1：阿柏西普； FP3：康柏西普康柏西普显示出更高的 VEGF亲和力。贝伐单抗的特异性使其不能与 VEGF-B和 VEGF-C以及 PlGF结合。康柏西普： EC50=28 pM 雷珠单抗： EC50=50 pMEC50：半数有效浓度，即能引起 50%最大效应的药物浓度。EC50值越大，说明药物的作用越低。康柏西普和雷珠单抗对 VEGF诱导的 HUVEC增殖活性的影响康柏西普的体外活性研究康柏西普对 HUVEC迁移的抑制作用呈现剂量依赖性，其 IC50为 7nM。IC50：半数抑制浓度， 即能引起 50%抑制效应的药物浓度。 IC50值越大，说明药物的作用越低 。康柏西普对 VEGF诱导的 HUVEC细胞迁移过程的影响康柏西普的体外活性研究康柏西普可显著抑制 VEGF诱导的微血管萌芽和毛细血管样网络形成。康柏西普对