病毒与细胞相互作用

第四章 病毒与细胞间的相互作用第一节 病毒的培养第二节 病毒与细胞的相互作用第一节 病毒的培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（ 动物接种 ） 、鸡胚（ 鸡胚接种 ） 或离体细胞进行分离培养（ 细胞培养 ） 。动物接种： 接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。鸡胚接种： 一种比较经济简便的方法。一般采用孵化 9-12天的鸡胚，按病毒种类不同接种于鸡胚的不同部位。可采用绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔接种。人或动物细胞在一定条件下可在实验室的培养瓶内生长。优点：n 每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等n 无个体差异，准确性和重复性好n 可严格执行无菌操作n 细胞培养本身就能显示病毒的生长特征n 应用空斑技术可进行病毒的克隆化细胞培养n 原代细胞（ primary cell） 动物组织经胰蛋白酶消化处理，使细胞分散而得到的细胞。n 二倍体细胞株（ diploid cell strain） 将长成单层的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样，保持其二倍染色体数目的细胞，称为二倍体细胞。n 传代细胞系（ established cell line） 能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成。（一）细胞的类型（二）细胞培养的方法1. 静置培养（ stationary culture） 实验室常用。细胞悬液装瓶， 5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。2. 旋转培养（ roller culture） 大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞帖附于玻瓶四周，长成单层。悬浮培养（ suspensive culture） 通过搅拌使细胞处于悬浮状态，并补充营养和校正 pH，使之生长或维持存活。微载体培养（ micro-carrier culture） 是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。微载体是直径 10035m的微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。第二节 病毒与细胞的相互作用n 杀细胞感染n 非杀细胞感染引致持续感染，对细胞代谢无影响。n 产生干扰素 生产性感染（ productive）， 病毒感染后能产生和释放子代病毒颗粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能是细胞死亡或细胞转化非生产性感染（ nonproductive） 或称顿挫感染（abortive infection） 病毒感染后不形成完整的病毒颗粒持续性感染（ persistent infection） 是指持续长时间的感染，感染过程中不形成感染性的病毒颗粒 病毒与细胞的相互作用感染的类型 对细胞的影响 是否产生传染性病毒颗粒例证杀细胞细胞病变（ CPE），细胞蛋白质、 RNA、 DNA合成被抑制。细胞死亡是甲型疱疹病毒、肠病毒、呼肠孤病毒持续性、生产性无 CPE，细胞代谢无甚妨碍，细胞继续分裂，某些分化的细胞可失去某些功能是瘟病毒、砂粒病毒、狂犬病毒、大多数反录病毒持续性、非生产性 通常无影响 否，但可通过共培养等诱导 脑组织的犬瘟热病毒转化细胞形态改变，细胞可无限制传代移植至实验动物可产生肿瘤否，致肿瘤 DNA病毒是，致肿瘤反录病毒多瘤病毒、腺病毒鼠、禽白血病病毒一、病毒引致的杀细胞变化细胞病变效应 (cytopathic effect,CPE) 由病毒感染导致的细胞损伤。 CPE能在光学显微镜下观察。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。细胞肿大 细胞圆缩 形成合胞体病毒所致的细胞病变tissue culture cellsepithelial epithelioid fibroblasticepithelial cells uninfected early infection late infectionslides from CDCfibroblastic cellsuninfected early infection late infectionslides from CDCFormation of multinucleated cells. 能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力 。半数组织细胞感染量（ tissue culture infectious dose 50, TCID50）涉及细胞膜的 CPE 有囊膜的病毒出芽过程中能将其融合蛋白直接插入宿主细胞膜，结果导致膜融合以及合胞体（ syncytia）形成。慢病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、某些疱疹病毒等感染 涉及细胞骨架的 CPE 微丝（如 actin）、中介丝（如 vimentin）及微管（如 tubulin）等细胞骨架与细胞结构的完整性、物质运输及运动性等有关。病毒引致的细胞凋亡与坏死 坏死（ necrosis）、 凋亡（ apoptosis） 图 2432-2 感染犬瘟热病毒凋亡的Vero细胞的电镜照片病毒感染抗体依赖的增强作用 （ Antibody-dependent enhancement of viral infection, ADE） 在病毒感染过程中，宿主产生的抗体与病毒结合，非但未能阻断病毒吸附宿主细胞，反而增强了病毒对细胞的感染，提高了病毒的滴度。 （一）空斑试验将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养中，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化的琼脂。病毒在细胞内复制后产生局限性病灶，病灶逐渐扩大，肉眼也能看见，此即 空斑 (plaque)。空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称为 空斑形成单位（ PFU） 。 病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的 PFU来表示。 空斑试验的用途：1. 测定病毒数量2. 纯化病毒单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可获得病毒克隆。3. 鉴定病毒不同病毒的空斑具有不同的特征。（二）包涵体（ inclusion body)定义： 是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，称为包涵体。图 324-4 疱疹病毒的包涵体包涵体的性质n 病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的 Negri氏体n 大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体n 细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体定义： 由病毒或诱