生化大实验实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

纯度检测：1.SDS-PAGE测定 LDL纯度2.双向免疫扩散测定 LDL纯度含量测定：1.Folin-酚试剂法测定 LDL含量SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 LDL纯度一、目的要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握 SDS 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（ SDS-PAGE）分离蛋白质技术电泳概述： 电泳： 带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。 影响电泳的主要因素： 1） 电泳介质的 pH 2） 缓冲液的离子强度 3） 电场强度 4） 电渗作用 5） 对支持物的选择 6） 温度对电泳的影响 电泳分类： 按原理分：区带电泳、移界电泳、等速电泳、聚焦电泳二、 原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 (Acr)和交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 (Bis)在加速剂 N，N， N， N 四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵 (APS)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的区带电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对 pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要 Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达 10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 凝胶浓度 (T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表 3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度 /(%) 蛋 白 质104 20-30 1-410 4 15-201-510 4-110 5 10-15 110 5 5-10 510 5 2-5 核酸 (RNA) 104 1520 10410 5 5-10 105-210 6 2-2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳 (如图 1)和板状电泳 (如图2)，两者电泳原理完全相同。 图 1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面 ,B为剖面 )(1)样品胶 pH6.7 (2)浓缩胶 pH6.7 (3)分离胶 pH8.9 (4)电极缓冲液 pH8.3图 2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝6.上贮槽 7.冷凝系统 图 3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框 返回 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由 APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为 pH6.7的 Tris-HC1。 分离胶是由 APS催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为 pH8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、 3种 pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、 pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。不连续凝胶分离蛋白质原理：（ 1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及 pH值的不连续性； 在 pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子： HC1解离出的氯根 (C1-)尾随离子 (trailing ion)或慢离子：甘氨酸根mclclmppmGG(Cl代表氯根， P代表蛋白质， G代表甘氨酸根 )有效迁移率 =m， m为迁移率， 为解离度) 当进入 pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（ c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应图 4 电泳过程示意图A为电泳前 3层凝胶排列顺序， 3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。图 5 不连续系统浓缩效应示意图 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE） ： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)， 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用 SDS-PAGE测定蛋白质分子量。SDS的作用 SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成 SDS-蛋白质复合物。在一定条件下， SDS与大多数蛋白质的结合比为 1.4g SDS/1g蛋白质。由于 SDS带有负电荷，使各种 SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷和形状的影响，电泳速度只与蛋白质的分子量有关。 蛋白质染色 常用蛋白质染色的几种方法： 1）氨基黑 10B 2）考马斯亮蓝 R250 3）考马斯亮蓝 G250 4）固绿 5）荧光染料 ： （ l）丹磺酰氯（ 2， 5-二甲氨基萘磺酰氯，简称 DNS-Cl）： （ 2）荧光胺： （ 3） 2-甲氧基 -2， 4-二苯基 -3-呋喃酮（ MDPF）： （ 4） 1-苯胺基 -8-萘磺酸（简称 ANS）： 6）银染色法 常用脂蛋白染色方法： 1）油红 O染色 2） 苏丹黑 B三、试剂与器材试剂： 10%SDS、 分离胶胶贮液（ 30 ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（ 3.0 mol/L pH8.9Tris HCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris HCl 缓冲液）、 10%过硫酸铵（ APS)、 1%四基乙二胺（ TEMED）及原液、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 0.05考马斯亮兰R250染色液 、脱色液、水饱和正丁醇、 50%丙三醇器材：稳压稳流电泳仪、脱色摇床、垂直板电泳槽、电泳槽配件（玻板、 T型条、十孔梳、棕色梳、加样指示板）、烧杯、试管、微量移液器、微量进样器五、 操作方法1.安装 夹心式垂直板电泳槽 (1)旋松固定螺丝并打开电泳槽，仰放在桌面上。(2)在长、短玻璃板间加 T型条，短玻璃板在下放入硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。(3)将电泳槽两侧固定螺丝以对角线的方式旋紧。(4)竖直电泳槽，在长短玻璃板间加蒸馏水检漏。2.配胶： SDS-不连续体系凝胶配制 20ml分离胶（ 7.5%）所需试剂用量（ ml） 分离胶胶贮液 30 ACr-0.8%Bis 5.00 分离胶缓冲液 pH8.9Tris HCl 2.50 10%SDS 0.20 1%TEMED 2.00 双蒸水 10.2 10%过硫酸铵（ APS) 0.10 5%浓缩胶所需试剂用量（ ml） 分离胶胶贮液 30 ACr-0.8%Bis 0.65 浓缩胶缓冲液 pH6.7Tris HCl 1.00 10%SDS 0.08 TEMED原液 0.005 50%丙三醇 2.30 10%过硫酸铵（ APS) 0.063. 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度依据电泳槽标记，约 7ml。并在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层水饱和正丁醇 (约 3 4 mm)， 用于隔绝空气，使胶面平整。 约 30-60 min凝胶完全聚合，因聚合过程析出水，可看到胶面增加一条界面线。将凝胶表面的蒸馏水倒去 ，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内 (即分离胶上方 )，距短玻璃上缘 0.2 cm处，轻轻加入样品槽模板即十孔梳。静置电泳槽， 10 min左右，上胶即可聚合，再放置 10-20 min，拔出梳子，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约 0.5 cm，即可加样。 4. 样品的处理及加样将样品按 0.51 mg/ mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子 (不要塞紧，以免加热时迸出 )，在 100 沸水浴中加热 3min， 取出冷却后加样。用微量进样器取 25 l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。5 .电泳盖上电泳槽盖子，将电泳仪的正极与电泳槽红色连线连接，负极与黑色连线连接，打开电泳仪开关，开始时电流为 10 mA， 待样品进入分离胶后，将电流调至 20-30 mA， 当溴酚蓝染料距硅胶框 1 cm时，停止电泳，关闭电源。6 .染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用棕色梳撬开短玻璃板， 从凝胶板上切下一角作为加样标记， 加入染色液染色 1 h， 再用脱色液脱色过夜，直至蛋白质区带清晰，即可观察蛋白质纯度或计算相对迁移率。7. 结果观察与处理：量出加样端距电泳溴酚兰前沿的距离 (cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离 (cm)， 按下式计算相对迁移率 mR:相对迁移率 mR= 蛋白质样品距加样端迁移距离 (cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离 (cm)六、注意事项（ 1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝（对角旋紧），避免缓冲液渗漏。（ 2）上层浓缩胶聚合快，加入 10%APS后快速混匀，及时转移至玻板之间，并快速插入十孔梳，以免样品孔变形 。 （ 3）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有