硕士毕业论文

食品中苏丹红 I的免疫学快速检测方法研究n 前言苏丹红 I（ 1-苯基偶氮 -2-萘酚），属于苏丹红染料的一种，作为化学合成染料，主要应用于鞋油、化妆品等工业产品及其他着色剂等领域。 苏丹红 I在体内代谢，可被还原为初级代谢产物苯胺和 1-氨基 -2-萘酚，这些物质会攻击肝细胞，引起中毒性肝病，也可造成神经系统损害，是一种遗传毒性致癌物。苏丹红 I前言 -苏丹红 I检测现状n 目前食品中苏丹红 I的检测主要辅助仪器（ HPLC 、 IAS-HPLC ）进行检测，而仪器检测方法普遍存在的缺陷在于：1. 检测仪器昂贵2. 检测成本高3. 操作复杂4. 耗时长5. 需专业人员操作6. 不适宜现场抽查及推广应用免疫学检测技术解决食品中苏丹红 I快速检测的问题！一 . 研究内容苏丹红 I多抗制备及鉴定研究内容苏丹红 I免疫学检测方法建立间接竞争ELISA方法胶体金免疫层析试纸条法1. 苏丹红 I多克隆抗体的制备苏丹红 I多克隆抗体的 纯化 及含量测定苏丹红 I多克隆 抗体 的制备苏丹红 I衍生物 -明胶免疫 抗原 的合成 苏丹红 I多抗制备免疫原的制备： 利用重氮法合成带有羧基的苏丹红 I衍生物 利用混合酸酐法合成苏丹红 I-明胶复合物 对氨基苯甲酸2-萘酚苏丹红 I衍生物苏丹红 I衍生物明胶 苏丹红 I衍生物 -明胶1.1 苏丹红 I免疫原的制备首次免疫： 0.5 mL完全弗氏佐剂 + 0.5 mL 2 mg/mL免疫原 , 于兔背部注射。2 周 后 : 0.5 mL不完全弗氏佐剂 + 0.5 mL 2 mg/mL免疫原，足掌注射。每隔 10天 : 于兔耳缘静脉注射免疫抗原 1.0mL，加强免疫 3次。最后一次免疫后的 7 10天试血。2.3 苏丹红 I多抗的制备选择体重 2 kg的雄性新西兰兔，按照常规免疫程序，制备多克隆抗体。整个免疫过程为 2 3个月。2.4 多克隆抗体的纯化辛酸硫酸铵法亲和层析法2.1 苏丹红 I衍生物的合成结果苏丹红 I衍生物红外图谱鉴定a- 苏丹红 Ib- 衍生物b曲线在 1700cm-1处存在较强的吸收峰表明反应产物的结构上基本连接羰基。2.2 苏丹红 I衍生物的色谱分析结果2.3 苏丹红 I免疫原的合成结果a曲线显示 苏丹红 I在 500nm处有强的特征吸收峰；b曲线显示 明胶 在 220nm处有强的特征吸收峰；c曲线同时具有 苏丹红 I和 明胶 的特征，表明苏丹红 I与明胶偶联成功。 苏丹红 I免疫原紫外扫描结果2.4 SDS-PAGE测定 IgG的纯度M- 低分子量 Maker； 1- 苏丹红 I抗血清；2- AC纯化抗体；3- CA-AS纯化。1. 苏丹红 I抗血清，有多条带，含有较多杂蛋白；2. 经 CA-AS纯化后，有 3-4条较明显的条带，血清经纯化后，大部分杂蛋白被除去；3. 经 AC纯化后，有两条明显条带，一条为重链，分子量约 55KD，另一条为轻链，分子量约 14 KD，与IgG抗体的重链和轻链的分子量较符合，纯化后的抗体 纯度较高 。2.5 特异性 IgG的浓度测定根据 BCA法的标准曲线y=0.5198x + 0.2464，R2=0.9778，计算得到 :辛酸硫酸铵纯化的抗体浓度为 4.24 mg/mL，亲和层析柱纯化的抗体浓度为 1.93 mg/mL。BCA法测定蛋白质浓度一 . 研究内容苏丹红 I多抗制备及鉴定研究内容苏丹红 I免疫学检测方法建立间接竞争ELISA方法胶体金免疫层析试纸条法2.1 间接竞争 ELISA方法的建立1.苏丹红 I抗体 效价 的测定 研究内容 3.建立 间接竞争 ELISA检测方法 2.苏丹红 I抗体 亲和力 的测定 4.待测样品的 前处理 2.1.1 苏丹红 I抗体效价的测定抗苏丹红 I特异性抗体 效价测定效价为 1:32 0002.1.2 苏丹红 I抗体亲和力的测定 本实验利用 竞争 ELISA法，测定抗体的亲和力。 若抗体具备较强的亲和力强，则较少量半抗原即可产生 50 % 的抑制率，故常用 IC50， 即产生 50 %抑制率时半抗原的浓度，来表示抗血清的亲和性，以 10 % 抑制率时的苏丹红 I浓度作为最低检测限。 抑制率 =100 %-(OD 1-OD阴性 ) /（ OD2-OD阴性 ） 100 % ，其中， OD1为竞争孔的 OD值， OD2为不含苏丹红 I孔的 OD值。抗血清亲和性 IC50： 15.0 ng/mL，最低 检 测 限 IC10 ： 1.0 ng/mL。2.1.3 间接竞争 ELISA的建立 酶标记的 苏丹红 I抗原 与待测样品中可能存在的 苏丹红 I竞争性的与固相载体上的 苏丹红 I抗体结合 ，显色程度与样品中苏丹红 I含量成反比。根据待测样品的 OD值，推算出样品中的苏丹红 I的浓度。2.1.4 待测样品的处理实际添加量(g/kg)ELISA检测量(g/kg)加标回收率（ % ）变异系数(n=3)/ (%)4.00 3.81 95.25 6.68.00 6.87 85.88 4.916.00 15.65 97.83 7.432. 0 30.56 95.50 6.2称取 2.0 g的空白辣椒粉样品，准确加入 10 mL乙腈，均质 2 min，超声 15 min。滤纸过滤后过无水硫酸钠柱去水，所得溶液用真空旋转蒸发仪 40 旋转蒸干，甲醇 -0.02mol/L PBS0.2 mL溶解残渣。实验结果测得辣椒粉中苏丹红 I的加标回收率为 85.88%- 97.83%2.1.5 交叉反应率测定n 用建立的间接竞争 ELISA法测定苏丹红其他染料，计算苏丹红 I抗体的交叉反应率。n 结果表明该方法与苏丹红 II、苏丹红 III和苏丹红IV的交叉反应率分别为 2.7% 、 6.5% 和 4.1% ，仅有较低的交叉反应性，说明该方法的特异性良好。二 . 免疫学检测方法的建立检测方法的建立苏丹红 I的胶体金免疫层析方法苏丹红 I的间接竞争ELISA法2.1 金免疫层析技术概述胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的一项新型体外快速诊断技术，该技术发展迅速，已在食品安全、医学检测、农药畜牧、生物反恐等多应用领域中得到了广泛发展。本研究应用 竞争抑制免疫层析 的原理，样品中的苏丹红I在流动的过程中与金标苏丹红 I抗原，竞争结合 NC膜检测线上苏丹红 I多克隆抗体。通过检测线 T是否显色判断结果。2.2 金免疫层析试纸工作原理强阴性 阴性 怀疑 阳性2.2 胶体金免疫层析试纸法的建立1.胶体金溶液的制备研究内容 3.免疫层析试纸的制备2.金标抗原的制备4.试纸条的检测 2.2.3 胶体金溶液的制备胶体金的制备多采用还原法。本研究利用 柠檬酸三钠还原法 制备 24.5 nm的胶体金。2.3.4 金标记抗原的制备1. 用 0.2 mol/L的 K2CO3调节金溶胶至 pH 9.0；2. 将苏丹红 I抗原与胶体金结合，搅拌 15 min；3. 加入 PEG20 000，静止 2h。低速离心 25 min；4. 取上清，高速离心 50 min，弃上清；5. 用稀释液将沉淀恢复至原体积，高速离心 50 min；6. 将沉淀（金标抗体）恢复至原体积的 1/10。1.硝酸纤维素膜的选择条件优化3.金标抗原喷涂量的选择2.NC膜上抗体浓度的选择2.3.4 免疫金试纸条的制备 0.45 m孔径的 NC膜 C线浓度：线浓度： 0.6mg/mL T线浓度：线浓度： 0.6mg/mL 5 uL/4 4 (mm)优化结果2.3.5 胶体金免疫层析试纸的测试n 配制标准浓度的待测液，使得苏丹红 I的浓度分别为0, 5, 10, 15, 20 g/kg。n 取 90 uL滴加在试纸的样品区， 10 min后观察结果。结果判断：若 C、 T亮度基本一致，表示阴性结果；若 C线亮度明显亮于 T线，表示阳性结果；若均未出现 C、 T两线，表示该试纸无效。2.3.6 试纸条测试结果苏丹红 I浓度达 10 ug/kg时，检测线 T的颜色明显变淡，即试纸条的检测限为 10g/kg。各重复数值的变异系数 9.23% 。0 5 10 15 20浓度 /(g/kg)2.3.7 实际样品测定n从市面上随机购买两种辣椒粉样品，分别进行从市面上随机购买两种辣椒粉样品，分别进行试纸条和试纸条和